м этанолом, 0,1 ? ацетатом натрия и осторожно подсушивают осадок в потоке азота. После этого осадок легко растворяется в стерильной воде или в буфере для дальнейшей работы. Выход и чистоту препарата РНК оценивают по поглощению разбавленной пробы при 260 и 280 нм: 1 мг/мл РНК эквивалентен 23 единицам поглощения при 260 нм, и чистая РНК имеет соотношение Л2бо: ^280 = 2,0.

Две методики выделения РНК с использованием описанных выше процедур суммированы в табл. 3 для целой ткани и в табл. 4 для культуры клеток.

2.3.2. Методы с использованием солей гуанидиния

В последние годы был разработан ряд сходных методов выделения РНК без использования фенола [8—10]. Они основаны на способности солей гуанидиния в высоких концентрациях и других денатурирующих агентов разрушать комплекс рибо-нуклеопротеинов (РНП) и особенно полезны для клеток с высоким уровнем эндогенной рибонуклеазной активности. Например, Чиргуин и др. [8] описали оптимальные условия выделения интактной РНК из поджелудочной железы крысы. Для этого ткань быстро разрушают в присутствии 0,1%-ного 2-меркаптоэтанола, 4 ? гуанидинийтиоцианата (чтобы восстановить и денатурировать рибонуклеазы), центрифугируют и осаждают РНК из супернатанта этанолом, подкисленным уксусной кислотой. Осадок растворяют в 7,5 ? гуанидинийхлориде и снова осаждают РНК этанолом. Эту операцию повторяют и переосаж-

Выделение эукариотической матричной РНК

261

Таблица 5. Выделение РНК в присутствии гуанидинийтиоцианата [8]

1. Быстро и тщательно прогомогенизируйте ткань в течение 30—60 с в гомогенизаторе с тефлоновым пестиком, присоединенным к скоростному электромотору, в 20 объемах следующего буфера при 20 °С:

4 ? гуанидинийтиоцианат 0,5%-ный (вес/объем) саркозил 0,1 ? 2-меркаптоэтанол 0,1%-ный (по объему) Antifoam A (Sigma) (противовспенивающая добавка) 25 мМ цитрат натрия, рН 7,0

2. Отцентрифугируйте 10 мин при 8500g при 10 °С.

3. Отберите супернатант, добавьте к нему 0,025 объема 1 ?1 уксусной кислоты и 0,75 объема этанола, тщательно перемешайте и оставьте на ночь при — 20 °С.

4. Отцентрифугируйте 10 мин при 5000g при —10 °С.

5. Слейте супернатант и как следует ресуспендируйте осадок, гомогенизируя его в 0,5 объема (относительно объема буфера при первоначальной гомогенизации) 7,5 ? гуанидинийхлорида, 5 мМ ДТТ, 25 мМ цитрата натрия, рН 7,0. Иногда помогает кратковременное прогревание при 68 °С.

6. Снова осадите РНК, добавив 0,025 объема (относительно объема гуанидинийхлорида) 1 ? уксусной кислоты и 0,5 объема этанола. Оставьте смесь при —20 °С не менее чем на 3 ч.

7. Отцентрифугируйте, как в п. 4.

8. Повторите операции пп. 5—-7, уменьшив все объемы вдвое.

9. Удалите супернатант, тщательно ресуспендируйте осадок в этаноле при комнатной температуре и отцентрифугируйте, как указано в п. 4.

10. Слейте спирт и подсушите осадок слабым током чистого азота.

11. Растворите РНК в холодной воде (1 мл на 1 г исходной ткани) и осветлите раствор центрифугированием при 22 500g при 10 °С в течение 10 мин.

12. Сохраните супернатант и ресуспендируйте осадок в воде (0,5 мл на 1 г исходной ткани). Затем отцентрифугируйте осадок, как указано в п. 11. Отберите супернатант.

13. Объедините супернатанты (п. 11 и 12), добавьте 0,1 объема 2 ? ацетата калия, рН 5,0, и 2 объема этанола, перемешайте и оставьте на ночь при —20 °С.

14. Отцентрифугируйте препарат 20 мин при 13 OOOg при —10 °С.

15. Отбросьте супернатант, ресуспендируйте осадок в 95%-ном этаноле и снова отцентрифугируйте, как указано в п. 14.

16. Подсушите осадок током азота и растворите в воде или в буфере (1 мл на 1 г ткани). Храните при —70 "С.

дают РНК этанолом. Методика, приведенная в табл. 5, с успехом применяется и для других тканей и культур клеток. Этот метод был модифицирован: исходный гомогенат наслаивают на раствор хлористого цезия с достаточно высокой плотностью, чтобы ДНК не осаждалась при последующем центрифугировании [8]. Затем РНК, которая в этих условиях осаждается на дно, ресуспендируют в гуанидинийхлориде и промывают с помощью переосаждения этанолом. Эта модификация особенно удобна для выделения небольших количеств РНК. Есть сообщение, что полученный таким образом препарат из печени в пять раз активнее при трансляции, чем мРНК, полученная фенольной экстракцией [9]. t

262

Глава 8

2.3.3. Метод выделения РНК с использованием раствора LiCl и мочевины

Для получения интактных, активных в трансляции мРНКиз различных источников может быть использован метод гомогенизации замороженной ткани в ЗМ LiCl, 6? мочевине [10]. В этих условиях рибонуклеазы ингибируются и происходит осаждение РНК, почти свободной от фрагментов ДНК, полисахаридов и белков. В табл. 6 описана методика, которая впервые была использована для выделения иммуноглобулиновой мРНК из мышиных миеломных опухолей [10].

Таблица 6. Выделение РНК в растворе хлористого лития и мочевины [10]

1. Прогомогенизируйте замороженную ткань в 10 мл 3 ? LiCl, 6 ? мочевины на 1 г ткани 2 мин при 0°С в гомогенизаторе Уоринга на максимальной скорости. Оставьте гомогенат на ночь при 0 "С.

2. Отцентрифугируйте гомогенат 20 мин при 16 OOOg при 0 "С. Отбросьте супернатант.

3. Растворите осадок в 0,5%-ном ДСН, 10 мМ трис-HCl, рН 7,6 (10 мл на 1 г исходной ткани), и проэкстрагируйте раствор равным объемом смеси хлороформ — изоамиловый спирт (24:1, по объему), встряхивая эмульсию в течение 10 мин.

4. Отцентрифугируйте смесь 10 мин при lOOOOg при 18 °С в пробирках из стекла Согех в бакет-роторе.

5. Соберите верхнюю (водную) фазу и продолжайте выделение, как указано в пп. 13—16 в табл. 5.

2.4. Выделение полисомной РНК

2.4.1. Высокоскоростное центрифугирование полисом

Если необходимо исследовать природу и состав популяции транслируемых мРНК в клетках (а не суммарную клеточную мРНК), то прежде, чем выделять собственно РНК, необходимо получить полисомы. Кроме того, с получения полисом часто начинают выделение индивидуальных мРНК В литературе имеется множество описаний выделения полисом с помощью дифференциального центрифугирования. Согласно классической методике, постмитохондриальный супернатант клеточного лизата или гомогената наслаивают на 1? сахарозу в нейтральном или слабощелочном буфере (рН 7,6—8,5) и центрифугируют (произведение ускорения на время центрифугирования составляет 3—4 -105 g" ч.). Затем полисомный осадок ресуспендируют в буфере для дальнейшего фракционирования или анализа. Общий метод выделения полисом описан в табл. 7. Хотя, как правило, этот метод надежен, в некоторых случаях возникают сложности. На выделение полисом уходит сравнительно много времени, и часть мРНК может при этом деградировать под действием

Таблица 7. Общие методы получения и фракционирования 263 по размеру полисом из эукариотических клеток

Получение полисом

1. Суспендируйте ткань или клетки в трех объемах холодного буфера для выделения полисом1, имеющего следующий состав: 0,25 ? сахароза 0,1 М КО

5 мМ ацетат магния

6 мМ 2-меркаптоэтанол 20 мМ трис-HCl, рН 7,6

Прогомогенизируйте материал 3—20 движениями пестика в гомогенизаторе тефлон — стекло (Поттера) или стекло — стекло (Даунса)2, поддерживая температуру 4 °С.

'2. Отцентрифугируйте гомогенат 10 мин при 10 000g, чтобы удалить дебрис, плазматические мембраны, ядра и митохондрии.

3. Добавьте к постмитохондриальному супернатанту тритон Х-1003 до конечной концентрации 1% (по объему). Наслоите смесь на равный объем буфера для выделения полисом, содержащего 1,0 ? сахарозу.

4. Отцентрифугируйте 2 ч при 260 OOOg- при 4 °С4.

5. Отсосите и отбросьте супернатант. Осторожно промойте стенки центрифужной пробирки холодным буфером для выделения полисом без сахарозы. Переверните пробирку и дайте жидкости стечь на фильтровальную бумагу. Затем осторожно суспендируйте полисомы в холодном буфере для выделения полисом без сахарозы (0,5 мл на 1 г ткани) с помощью гомогенизатора Даунса.

"Фракционирование полисом по размеру

1. Для фракционирования полисом по размеру приготовьте сахарозные градиенты (например, 10—40%, 15—45%, 20—50%5) в холодном буфере, содержащем 0,1 ? КО6, 3 мМ ацетат магния, 20 мМ трис-HCl, рН 7,6.

2. Наслоите обработанный детергентом постмитохондриальный супернатант (п. 3 в верхней части таблицы) или ресуспендированные полисомы (п. 5 там же) на каждый градиент в минимальном объеме. Обычно на градиент объемом 10 мл наносят 100—400 мкг полисом (по РНК). Отцентрифугируйте 1 ч при 150 OOOg- при 4 °С5.

3. Фракционируйте градиенты, пропустив их через проточный денситометр с регистрацией поглощения при 260 нм со скоростью 1—5 мл/мин (скорость зависит от общего объема градиента). Раскапайте каждый градиент на 20—30 фракций для дальнейшего анализа или очистки РНК.

1 Описанный метод годится для такой ткани, как, например, печень. Состав буфера для выделения полисом можно изменять в зависимости от специфических особенностей исследуемой ткани. Например, для мышц необходимо использовать более высокую концентрацию соли, чтобы не вызвать осаждения сократительных белков; другие условия также могут существенно отличаться от указанных в настоящей таблице [11]. Для получения экстракта из многих типов культивируемых клеток млекопитающих и последующего выделения полисом можно использовать вместо приведенного способа (п. 1) гипотонический шок и лизис с помощью детергентов (гл. 9, табл. 11).

1 Тип гомогенизатора, величины его зазора и число движений поршня зависят от ткани, и их следует подбирать экспериментально.

3 Тритон Х-100 растворяет мембраны эндоплазматического ретикулума, освобождая связанные полисомы. Если детергент используют для лизиса клеток иа первой стадии (п. 1), то добавлять его еще раз уже ие нужно.

' Некоторые методики включают центрифугирование полисом через слой 2 ? сахарозы. В этом случае следует увеличить время либо скорость центрифугирования, чтобы выход полисом был максимальным. Выход полисом можно оценить, определяя количество РНК в препарате очищенных полисом.

5 Концентрации растворов сахарозы, формирующих градиент, время и скорость центрифугирования определяются пр