rative Research Sigma BRL, Pharmacia, Sigma

Sigma

BRL, Enzo Biochem. Inc., Sigma, P-S

Biochemicals BRL

мы продают особо чистые реактивы, свободные от примеси рибонуклеаз, например сахарозу (табл. 2). Лучше всего стерилизовать растворы сразу после приготовления, пропуская их через мембранный фильтр (размер пор 0,22 мкм) или автоклавируя. Остаточное рибонуклеазное загрязнение можно полностью удалить с помощью обработки растворов 0,2%-ным (конечная концентрация) ДЭПК [3] в течение 12 ч; но прежде чем использовать эти растворы, следует удалить ДЭПК прогреванием (100 °С, 15 мин), поскольку он может реагировать с нуклеиновыми кислотами. ДЭПК нельзя использовать для обработки растворов, содержащих трис-буферы, так как он реагирует с первичными аминами.

Фенол, часто используемый для выделения мРНК, также должен быть насколько возможно чистым. Его легко перегнать под тягой, поддерживая необходимую температуру колбонагре-вателя (160 °С) и используя холодильник с воздушным охлаждением для сбора перегнанного жидкого фенола. Во время этой процедуры соблюдайте строгие меры предосторожности (в частности, одевайте защитные очки). Жидкий дистиллят собирайте в стерильную воду и храните при —20 °С в виде водонасыщен-ного раствора. Используйте для перегонки достаточно чистый

Выделение эукариотической матричной РНК

257

фенол и прекратите перегонку, когда в перегнанной колбе еще остается некоторое количество жидкости, чтобы снизить опасность взрыва. Фенол не должен попадать на кожу, так как он может вызвать серьезные ожоги, которые потребуют срочных мер первой помощи. При работе с РНК всегда надевайте пластиковые перчатки; во-первых, чтобы защитить руки от фенола и, во-вторых, чтобы рибонуклеазы кожи не попали в растворы.

2.2. Выбор метода выделения РНК

Описано множество методик выделения РНК из животных и растительных клеток и тканей. Выбор определенной методики зависит от конкретных задач эксперимента и от свойств исходного биологического материала. Прежде всего следует решить, выделять ли РНК из целых клеток или из какой-либо субклеточной фракции (скажем, из ядра, цитоплазмы, полисом или пост-рибосомного супернатанта). В следующем разделе описаны методы выделения РНК из гомогенатов целых клеток (или тканей) и цитоплазматических фракций. В разд. 2.4 рассмотрены особые методы получения РНК из суммарной фракции полисом или отдельных субфракций этих органелл. Выбор методики определяется задачами исследования. Некоторые аспекты этой проблемы обсуждаются в обзоре Тейлора [4]. Вообще говоря, и для животных, и для растительных тканей пригодны одни и те же методы при условии, что приняты все необходимые меры предосторожности для подавления рибонуклеазной активности (разд. 2.7).

2.3. Выделение РНК из целых клеток или цитоплазматических фракций

2.3.1. Фенольные методы

В большинстве методов выделения РНК, которые начинаются с получения неочищенных гомогенатов или экстрактов клеток, для денатурации белка и его отделения от нуклеиновых кислот используют фенол. Как правило, ткань гомогенизируют в забуференных солевых растворах, иногда содержащих 0,35 ? сахарозу, чтобы предотвратить разрушение лизосом и высвобождение рибонуклеаз. Для разрушения субклеточных мембран часто добавляют неионные детергенты типа тритона Х-100 или Nonidet Р-40. Некоторые прочные ткани приходится перед добавлением раствора для гомогенизации растирать в жидком азоте. Для подавления рибонуклеаз используют большие объемы раствора, в которых они сильно разводятся (10—20-кратные по отношению к весу ткани), а также высокие значения рН (8,5—

17—953

258

Глава 8

Таблица 3. Выделение цитоплазматической РНК из печени методом фенольной экстракции [6]

1. Ополосните ткань и гомогенизируйте ее в 15 объемах холодного буфера, имеющего состав:

0,35 ? сахароза

50 мМ КО

10 мМ ацетат магния

1,3%-ный тритон Х-100

0,2 ? трис-ацетат, рН 8,5

2. Отцентрифугируйте 5 мин при 2000g, чтобы осадить ядра.

3. Соберите супернатант, добавьте ДСН до 1 % и ЭДТА до 2 мМ и продолжайте выделение при комнатной температуре.

4. Встряхивайте супернатант 10 мин с 2 объемами смеси фенол —хлороформ (1 : 1, по объему), предварительно уравновешенной буфером, содержащим все перечисленные компоненты.

5. Отцентрифугируйте 10 мин при lOOOOg при 20 DC.

6. Соберите верхнюю (водную) фазу и перенесите ее в лед. Постарайтесь не загрязнить ее материалом интерфазы.

7. Встряхивайте фенольный слой и интерфазу с равным объемом 0,1 ? ацетата натрия, 2 мМ ЭДТА, 0,1 ? трис-ацетата, рН 9,0.

8. Отцентрифугируйте, как в п. 5.

9. Объедините водный слой с предыдущей верхней фазой (п. 6) и снова проэкстрагируйте равным объемом смеси фенол — хлороформ.

10. Отцентрифугируйте, как в п. 5.

11. Соберите водную фазу. Добавьте ацетат калия, рН 5,5, до 0,2 ? и осадите РНК 2,5 объемами холодного (—20 °С) этанола. Перемешайте и оставьте при —20 °С на 16 ч.

12. Отцентрифугируйте 10 мин при 2000g при 0°С.

13. Отбросьте супернатант и промойте осадок, суспендировав его в 3 ? ацетате натрия, рН 6,0.

14. Повторите операции пп. 12 и 13.

15. Ресуспендируйте осадок в холодном 70%-ном этаноле, 0,1 ? ацетате натрия и отцентрифугируйте, как в п. 12.

16. Слейте супернатант и подсушите осадок слабым током чистого азота.

17. Растворите РНК в воде или буфере и храните при —70 "С1.

1 Гораздо безопаснее хранить РНК в виде суспензии в этаноле с ацетатом натрия (п. 15); в таком виде очищенная РНК хранится не менее года без деградации даже при —20 °С. — Прим. перев.

9,0) и ионной силы (0,2—0,5 ? соль). Последние два условия особенно важны при работе с растительными тканями [5]. Если нужна только цитоплазматическая РНК, то гомогенат вначале центрифугируют, чтобы удалить ядра, а затем добавляют какой-нибудь ионный детергент, например ДСН или саркозил (?-лаурилсаркозинат натрия), обычно вместе с ЭДТА, чтобы разрушить нуклеопротеиновые комплексы и подавить рибонук-леазную активность. Затем раствор экстрагируют фенолом или смесью фенола с хлороформом (1:1), предварительно насыщенными буфером для гомогенизации. Экстракцию проводят с помощью интенсивного встряхивания. Органическую и водную фазы разделяют центрифугированием, во время которого денатурированный белок собирается в интерфазе. РНК собирается

Выделение эукариотической матричной РНК

259

Таблица 4. Выделение цитоплазматической РНК из культуры клеток методом фенольной экстракции [7]

1. Отцентрифугируйте суспензию клеток 5 мин при 1000g и промойте клетки, ресуспендируя их в 10 объемах холодного фосфатно-солевого буфера (0,14 ? NaCl, 2,7 мМ КС1, 6,5 мМ Na2HP04, 1,5 мМ КН2РО<, рН 7,2).

2. Повторите центрифугирование и промывку еще трижды.

3. Суспендируйте клетки в холодном лизирующем буфере (5 мл буфера на 108 клеток), имеющем состав:

0,14 ? NaCl ; 1,5 мМ MgCl2

0,5% Nonidet Р-40

10 мМ трис-HCl, рН 8,6 \ плюс 10 мМ ванадилрибонуклеозидный комплекс или 1000 ед./мл ингибитора рибонуклеаз из плаценты человека Быстро перемешайте суспензию на встряхивателе1

4. Наслоите лизат на равный объем 24%-ной (вес/объем) сахарозы, 1 %-ного Nonidet Р-40 в холодном лизирующем буфере и оставьте на 5 мин при

5. Отцентрифугируйте 20 мин при 8500g в бакет-роторе (например, в роторе Sorvall НВ-4).

6. После центрифугирования отберите верхний слой и добавьте равный объем следующего буфера:

0,3 ? NaCl 25 мМ ЭДТА 2%-ный ДСН

0,4 мг/мл протеиназы К (BRL или Sigma) 0,2 ? трис-HCl, рН 7,5 Проинкубируйте 30 мин при 37"С.

7. Быстро встряхните материал с равным объемом смеси фенол—хлороформ—изоамиловый спирт (50:50:1, по объему), содержащей 0,1% 8-гидроксихинолина. Смесь должна быть предварительно уравновешена 0,15 ? NaCl, 1 мМ ЭДТА, 50 мМ трис-HCl, рН 7,5.

8. Отцентрифугируйте смесь 10 мин при lOOOOg при 18°С в стаканах из стекла Corex (Dupont).

9. Отберите верхнюю водную фазу и добавьте 2,5 объема холодного (—20 °С) этанола. Оставьте на 2—18 ч при — 20 °С, чтобы сформировался осадок РНК.

10. Отцентрифугируйте препарат 10 мин при 10 OOOg" при 4 °С в стаканах из стекла Согех.

11. Отбросьте супернатант и промойте осадок, ресуспендируя его в 75%-ном этаноле, 0,1 ? ацетате натрия, рН 5,3.

12. Отцентрифугируйте, как указано в п. 10. Отбросьте супернатант и подсушите осадок слабым током азота.

13. Растворите осадок в стерильной воде или буфере и храните при —70 °С.

Многие клетки не лизируются таким образом и будут полностью утеряны иа следующей стадии центрифугирования. Чтобы их разрушить, следует обработать суспензию в гомогенизаторе Даунса (со стеклянным пестиком). — Прим. перев.

в основном в верхнем водном слое, но некоторое ее количество захватывается интерфазным материалом. Поэтому интерфазу следует повторно экстрагировать свежей порцией буфера и объединить водные фазы. Чтобы улучшить выход РНК, можно уменьшить объем белковой интерфазы, кратковременно обрабо-

17·

260

Глава 8

тав перед фенольной экстракцией клеточный экстракт протеина-зой К (200 мкг/мл, 37°С, 30 мин). Присутствие хлороформа также способствует выходу РНК в водную фазу. В органическую смесь для экстракции часто добавляют и другие компоненты, например 1% (по объему) изоамилового спирта (чтобы понизить вспенивание) и 0,1% (вес/объем) 8-гидроксихинолина (в качестве антиоксиданта для фенола и хелатирующего агента для разрушения РНК-белковых взаимодействий).

Нуклеиновые кислоты осаждают из водного слоя добавлением 2,5 объема холодного (—20 °С) этанола в присутствии 0,2 ? соли (обычно используют ацетат натрия или калия) при рН 5,0. Это значение рН выбрано, чтобы свести к минимуму химическое расщепление РНК- Время, необходимое для осаждения, зависит от количества РНК; оно колеблется от 2 ч до 12— 16 ч при — 20 °С. Затем РНК осаждают центрифугированием и промывают холодным 70%-ным этанолом, 0,1 ? ацетатом натрия, чтобы удалить следы фенола. При ресуспендировании осадка в ЗМ ацетате натрия и последующем центрифугировании удаляются ДНК и низкомолекулярные РНК (тРНК и 5S-PHK), а также полисахариды и гликопротеины. Наконец препарат РНК снова промывают холодным 70%-ны