ции 251

7. Преимущества системы in vitro по сравнению с системами in vivo

Системы транскрипции — трансляции in vitro имеют ряд преимуществ перед системами in vivo (гл. 6).

1. Можно использовать в качестве матриц линейные фрагменты ДНК (разд. 5).

2. Легко можно исследовать факторы, регулирующие экспрессию генов [22].

3. Можно изучать сборку и процессинг мембранных белков, добавляя фракцию мембранных везикул [9].

4. In vitro легче идентифицировать белки, чувствительные к деградации клеточными протеазами, чем in vivo. Нам удалось идентифицировать in vitro неполные (оборванные) полипептиды и мембранные белки с нарушенной компартментацией, которые не обнаруживались in vivo (Pratt, неопубликованные данные).

5. В системе in vitro можно получать большие количества белков, которые очень слабо синтезируются in vivo из-за действия репрессоров, кодируемых клетками-хозяевами [4].

6. Включение меченых аминокислот весьма эффективно благодаря низкому содержанию эндогенных аминокислот в экстракте.

Другие аспекты сравнения систем in vitro и in vivo обсуждаются в гл. 6, табл. 1.

8. Возможные проблемы при использовании систем in vitro

Хотя системы транскрипции — трансляции in vitro, описанные в настоящей главе, обладают определенными преимуществами перед системами экспрессии генов in vivo (гл. 6), они имеют и ряд недостатков, которые вкратце изложены ниже.

1. Синтез крупных белков (с молекулярной массой, превышающей 70 кДа) может быть не очень эффективным из-за преждевременной терминации трансляции данных белков. Это легко обнаружить по характерному виду геля после электрофореза, в результате которого полосы располагаются в виде «лесенки». Иногда эту трудность можно преодолеть, сократив время инкубации (например, до 15 мин).

2. Полипептиды, синтез которых не закончился во время инкубации, могут быть удалены в процессе центрифугирования проб при 5000 g в течение 2 мин. При этом осаждаются новообразованные полипептиды, связанные с полисомами, и спектр белков в геле меньше напоминает «лесенку». Этот прием иногда облегчает выявление белков с низкой молекулярной массой.

252

Глава 7

3. Артефакты в системах in vitro — вещь обычная. Поэтому все эксперименты следует по возможности проводить параллельно in vivo и in vitro; в противном случае интерпретировать результаты следует с известной осторожностью.

4. В опытах in vitro в качестве меченой аминокислоты обычно используют [35S]-метионин; однако следует иметь в виду, что не все белки содержат метионин, а БЗО-экстракт обладает способностью частично удалять ?-формилметионин [23]. Следовательно, чтобы уверенно идентифицировать все белки, необходимо использовать в параллельных экспериментах какую-нибудь другую аминокислоту, например [14С]-лейцин.

5. При исследовании генов, клонированных в фаге ?, в системе in vitro два промотора ?, Рь и Pr, будут обусловливать транскрипцию фаговых генов наряду с клонированными генами. В системе in vivo с использованием УФ-облученных клеток-хозяев (гл. 6, разд. 2) экспрессию генов фага ? можно подавить ?-репрессором. Поэтому набор белков, полученный при инкубации in vitro, может оказаться гораздо сложнее, чем набор in vivo. Возможно, эту проблему можно решить, если получить БЗО-экстракт из лизогенного штамма, но результат будет зависеть от стабильности репрессора в условиях получения системы и ее хранения. Другая возможность состоит в добавлении очищенного репрессора в инкубационную смесь перед добавлением ДНК фага ?. Ни один из этих подходов пока не был использован.

Благодарности

Выражаю благодарность за предоставление мне субсидии Совета по медицинским исследованиям № G8203714CB.

Литература

1. Zubay G. Annu. Rev. Genet., 7, 267 (1973).

2. DeVries J. K., Zubay G. J. Bacteriol., 97, 1419 (1969).

3. Gold L. M., Schweiger ??. In: Methods in Enzymology, vol. 20, Moldave K. and Grossman L. (eds.), Academic Press Inc., London and New York, p. 537, 1971.

4. Collins J. Gene, 6, 29 (1979).

5. Pratt J. M., Boulnois G. J., Darby V., Orr E., Wahle E., Holland 1. B. Nucleic Acid Res., 9, 4459 (1981).

6. O'Farrell P. Z., Gold L. ??. J. Biol. Chem., 248, 5512 (1973).

7. Konings R. N. H. In: Methods in Enzymology, vol. 20, Moldave K- and Grossman L. (eds.), Academic Press Inc., London and New York, p. 537, 1980.

8. Blobel G., Dobberstein B. J. Cell Biol., 67, 835 (1975).

9. Pratt J. ??., Holland 1. В., Spratt B. G. Nature, 293, 307 (1981). 10. Sutcliffe J. G. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 3737 (1978).

Прокариотические бесклеточные системы транскрипции — трансляции 253

11. Chang С. ?., Model P., Blobel G. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 1251 (1979).

12. Jackson ??., Pratt J. ??., Holland 1. B. FEBS Lett., 163, 221 (1983).

13. Yang H., lvashkiv L., Chen H., Zubay G., Cashel ??. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 7029 (1980).

14. Tomizawa J., Ogawa H. Nature New Biol., 239, 14 (1972).

15. Yang H., Heller K., Gellert M., Zubay G. Proc. Natl Acad Sci. USA, 76, 3304 (1979).

16. Seeburg P. H., Nusslein C, Schaller H. Eur. J. Biochem., 74, 107 (1977).

17. Gellert ??. Annu. Rev. Biochem., 50, 879 (1981).

18. Horinouchi S., Weisblum B. J. Bacteriol., 150, 815 (1982).

19. Shivakumar J. H., Dubnau D. Plasmid, 2, 279 (1979).

20. Shaw W. V. CRC Crit. Rev. Biochem., 14, 1 (1983).

21. Leventhal J. ??., Chambliss G. H. Biochim. Biophys. Acta, 564, 162 (1979).

22. De Crombrugghe В., Pastan I., Shaw W. V., Rosner J. L. Nature New Biol., 241, 237 (1973).

23. Jerez C, Weissbach H. J. Biol. Chem., 255, 8706 (1980).

ГЛАВА 8

ВЫДЕЛЕНИЕ ЭУКАРИОТИЧЕСКОЙ МАТРИЧНОЙ РНК (мРНК)

М. Клеменс

1. Введение

В течение последнего десятилетия выделение мРНК и ее трансляция in vitro стали использоваться особенно широко. Подобные работы заложили основу для развития технологии рекомбинантной ДНК, с помощью которой в настоящее время удается получать много ценной информации в области биологии и медицины. Кроме того, изучение отдельных мРНК, выделенных в чистом виде, и их продуктов трансляции внесло важный вклад в понимание регуляции экспрессии генов в клетке на различных уровнях. Все это стало возможным благодаря разработке методов получения недеградированных биологически активных мРНК из самых разнообразных источников. В настоящей главе описаны методы выделения мРНК из эукариотических клеток. Выделение мРНК из бактерий не рассматривается, ¦оно было описано в ряде более ранних обзоров [1, 2]. К тому же во многих случаях нужда в выделении такой мРНК отпала, так как были разработаны системы сопряженной транскрип-,ции — трансляции (гл. 7).

2. Выделение и очистка матричной РНК

Поскольку эукариотические мРНК выделяют из множества ^различных клеток и тканей, в литературе описано много различных методик. Они обладают определенными общими чертами, и к ним предъявляется ряд общих требований. Перечислим основные из них:

1. Необходимо как можно полнее отделять РНК от белка, .а в некоторых случаях и от ДНК.

2. Чтобы получать интактную и, следовательно, биологически активную мРНК, необходимо подавлять рибонуклеазную .активность как во время выделения РНК, так и впоследствии.

3. Многие методики включают отделение определенных видов мРНК от других мРНК и от РНК других классов.

Выбор тех или иных методик диктуется характером предпринимаемых исследований и свойствами используемого биоло-.гического материала.

Выделение эукариотической матричной РНК

255»

2.1. Оборудование и растворы

Исследователи, занимающиеся выделением мРНК, должны проводить эксперименты крайне тщательно, чтобы избежать ри-бонуклеазного загрязнения образцов. Рибонуклеазы — очень активные ферменты, и достаточно ничтожного их количества, чтобы инактивировать мРНК. Как преодолеть трудности, связанные с эндогенной рибонуклеазной активностью биологического' материала, описано ниже, в разд. 2.7. Чтобы избежать рибо-нуклеазного загрязнения из посторонних источников, необходима соответствующая организация лабораторной работы. Основные требования перечислены в табл. 1 и более подробно описаны ниже.

Таблица 1. Предосторожности против рибонуклеазного загрязнения при выделении мРНК1

Прокалите или проавтоклавируйте стеклянную посуду; проавтоклавируйте -пластиковую посуду.

Для приготовления растворов используйте автоклавированную воду.

Используйте реактивы максимальной имеющейся чистоты.

Обрабатывайте все растворы для инактивации рибонуклеаз 0,2%-ным (конечная концентрация) ДЭПК; стерилизуйте их фильтрованием для удаления микроорганизмов.

Добавляйте в растворы ингибиторы рибонуклеаз (разд. 2.7), если это возможно.

Пользуйтесь пластиковыми или резиновыми перчатками

Оберегайте растворы и препараты РНК от пыли, прикосновения пальцев и т. п.

1 Подробнее см. в тексте.

2.1.1. Стеклянная и пластиковая посуда

Вся необходимая стеклянная и стерильная пластиковая посуда должна быть приготовлена заранее (желательно с некоторым запасом), а необходимую нестерильную посуду и оборудование следует обработать в сухожаровом шкафу (4 ч при 160 °С) или в автоклаве (~1 атм, 15 мин). Предварительно проверьте, какую максимальную температуру выдерживает пластиковое оборудование. Для работы с растворами РНК используйте по возможности стерильные пробирки одноразового использования.

2.1.2. Растворы

Растворы следует готовить из реактивов высшей доступной чистоты на дважды автоклавированной дистиллированной в стеклянном аппарате воде. Многие специализированные фир-

256

Глава 8

4

Таблица 2. Фирмы - производители реактивов для выделения мРНК

Особо чистые реактивы

Бычий сывороточный альбумин

(свободный от рибонуклеаз) ДТТ ЭДТА Формамид Гуанидинийхлорид Гуанидинийтиоцианат Nonidet Р-40 Фенол ДСН

Сахароза (свободная от рибонуклеаз) Тритон Х-100 Мочевина

Аффинные сорбенты

Oligo (dT) -целлюлоза Ро1у(и)-сефароза

Ингибиторы рибонуклеаз

Гепарин

Ингибитор рибонуклеаз из плаценты человека

Ванадилрибонуклеозидный комплекс

BRL, Enzo Biochem. Inc.

BRL, CBL

CBL

BRL

»

Fluka AG BRL, Sigma BRL

BRL, CBL BRL, CBL

CBL

BRL, CBL

BRL, Collabo