Биологический каталог




Транскрипция и трансляция. Методы

Автор Б.Хеймс, С.Хиггинс

ст-системы для очистки тех компонентов фракционированного экстракта клеток дикого типа, которые восстанавливают активность транскрипции или трансляции. В обзоре Зьюби [1] подробно рассмотрено использование сопряженных систем транскрипции— трансляции для изучения регуляции экспрессии генов.

Прокариотические бесклеточные системы транскрипции — трансляции 241

5. Использование линейных ДНК в качестве матриц

5.1. Экспериментальный подход

Все приведенные выше примеры транскрипции и трансляции основаны на использовании в качестве матриц плазмидных или фаговых ДНК. Плазмидную ДНК вносят в инкубационную смесь в нативной конформации — в виде ковалентно-замкнутых кольцевых молекул, большей частью отрицательно сверхспира-лизованных. Вместе с тем ДНК фага ?, имеющая линейную форму, служит хорошей матрицей для транскрипции. Поэтому казалось возможным, что фрагменты ДНК, образованные при расщеплении эндонуклеазами рестрикции, также должны быть хорошими матрицами для транскрипции. Однако попытки использовать небольшие линейные ДНК в системах транскрипции— трансляции in vitro имели лишь ограниченный успех. Чем короче фрагмент ДНК, тем труднее получить сколько-нибудь осмысленные результаты. Изучение стабильности ДНК-матрицы в обычных условиях инкубации по критерию растворимости в ТХУ показало, что кольцевая плазмидная ДНК весьма стабильна (менее 5% деградации), ДНК фага ? деградирует примерно на 30%, а сильнее всего деградируют линеаризованные молекулы плазмидной ДНК [13]. Причиной деградации линейных матриц служит экзонуклеазная активность, присутствующая в экстрактах Е. coli. Неожиданно высокая стабильность ДНК фага ? объясняется ее способностью замыкаться в кольцо во время инкубации посредством длинных липких концов, что делает ДНК устойчивой к действию экзонуклеаз. Линейные фрагменты ДНК (даже линеаризованные плазмиды с короткими липкими концами) не превращаются обратно в кольцо в условиях инкубации и потому быстро деградируют. Но даже в этом случае на коротких фрагментах линейной ДНК в качестве матриц удается получить полные полипептидные продукты, если использовать большие количества ДНК (не менее 5 мкг на пробу) [5]. Это дает возможность небольшой части молекул ДНК транскрибироваться до того, как они деградируют. Однако за такое же время инкубации гены со слабыми промоторами будут транскрибироваться очень слабо, и поэтому их продукты не удается идентифицировать, даже пользуясь этим приемом. К счастью, оба метода получения систем транскрипции — трансляции, описанные в настоящей главе, можно модифицировать так, чтобы стало возможным эффективное использование линейной ДНК любого размера.

5.1.1. Система Зьюби

Основным источником экзонуклеазной активности в клетках E.coli является экзонуклеаза V — продукт генов гесВ и гесС.

16-953

,242

Глава 7

О 40 80 120

Время, мин 1

(Рис. 7. Синтез белка на матрице линейной ДНК в присутствии экстракта, свободного от экзонуклеазы V. Синтез проводили на матрице ДНК pBR325, расщепленной Htndlll, в присутствии БЗО-экстракта из клеток N138reaBts. Через различные промежутки времени инкубации отбирали пробы объемом 3. мкл и определяли включение радиоактивности в белок в ТХУ-нерастворимой фракции (табл. 10).

'Мутация в любом из этихлокусов приводит к инактивации экзонуклеазы V [14]. В БЗО-экстракте, полученном из штамма гесВ, линейная ДНК сохраняется в течение по крайней мере 2 ч, однако в этом экстракте наблюдается высокий уровень синтеза белка в отсутствие добавленной ДНК, так как он содержит большое количество загрязняющих фрагментов хромосомной ДНК [12, 13]. Метод Зьюби включает две стадии, на которых происходит удаление хромосомной ДНК; вначале два центрифугирования при 30 000 g (разд. 2.4, стадии 9 и 10) приводят к осаждению крупных фрагментов ДНК; затем предынкубация .в течение 80 мин при 37 °С (раздел 2.4, стадия 11) в присутствии АТР вызывает деградацию оставшихся хромосомных фрагментов. Для второй процедуры необходима активная экзонук-леаза V. Поэтому можно использовать температурочувствитель-;ный штамм гесВ(Nl38recBts) и готовить экстракт при пермис-сивной температуре 30 °С. Для полной деградации хромосомных фрагментов приходится увеличить время предынкубации до 160 мин (разд. 2.4, стадия 11). В условиях инкубации, которые используются для транскрипции и трансляции in vitro (37 °С, непермиссивная температура), экзонуклеаза V неактивна, и экзогенная линейная ДНК выдерживает в этом экстракте 2 ч, тогда как в экстракте гесВ+-клеток'—5—10 мин. Синтез с лилейных матриц идет в таком экстракте около 100 мин (рис. 7).

Прокариотические бесклеточные шстемы транскрипции - трансляции 94*

1 . J_ ;3___4 5 6 7 8 9

14,3 к Да -

Рис. 8. Зависимость синтеза белка от концентрации ДНК при использовании в качестве матрицы линейной ДНК. Радиоавтография геля после электрофореза полипептидов, меченных [355]-метионином, которые были синтезированы в присутствии различных количеств ДНК pBR325, линеаризованной рестрик-тазой Pstl, в качестве матрицы и БЗО-экстракта из клеток N138rec5ts. Электрофорез проводили в 15%-ном ПААГ — ДСН. Дорожка 1 — белки — маркеры молекулярной массы; дорожка 2 — проба без ДНК; дорожки 3—8 соответственно 50 нг, 375 нг, 0,75 мкг, 1,5 мкг, 3 мкг, 5 мкг ДНК pBR325, расщепленной Pstl. Дорожка 9 — 2,5 мкг сверхспиральной ДНК pBR325. ???-?-лактамаза (пре-?*) видна только на дорожке 9, так как во всех других пробах соответствующий ген инактивирован в результате расщепления-рестриктазой Pstl. Pstl не затрагивает ген CAT.

ZZTVctoZ'Z° п*Т НИ30К (РИС- 8' Д°Р0Жка 2). и ™* ^лучения достоверных результатов достаточно всего 50 нг пик

(рис. 8, дорожка 3), тогда как для системы с S30 экстракто^гз клеток гесВ+ требуется 2-5 мкг ДНК [12]. экстРактом из

5.1.2. Система Голда к Швейгера

В методе Голда и Швейгера (разд. 3) нет проблемы загрязнения фрагментами хромосомной ДНК при использовании штаммов гесВ, так как все фрагменты ДНК удаляются на стадии хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе. Многие исследователи с успехом использовали экстракты, полученные этим способом из штаммов гесВ, для изучения белков, кодируемых определенными рестриктными фрагментами [13].

16*

244

Глава 7

5.2. Значение сверхспирализации

При трактовке результатов, получаемых с линейной ДНК в качестве матрицы, следует помнить о том, что in vivo ДНК может быть в сверхспиральном состоянии и это может менять эффективность экспрессии некоторых генов. Это особенно важно, когда изучают факторы, регулирующие экспрессию генов. В ряде работ с использованием очищенных систем транскрипции было показано, что в качестве матрицы для транскрипции отрицательно сверхспирализованная ДНК более эффективна, чем релаксированная форма той же молекулы [15]. Из структурных соображений очевидно, что отрицательные сверхвитки благоприятствуют раскручиванию двойной спирали. Поскольку полагают, что для образования комплекса инициации между РНК-полимеразой и промотором необходимо хотя бы частичное расплетание двойной спирали, наблюдаемая стимуляция транскрипции под действием сверхспирализации, возможно, связана со снижением энергии активации, необходимой для образования комплекса инициации. Сверхспирализация может усиливать транскрипцию двумя путями: увеличивая частоту инициации на работающих промоторах и делая доступными для транскрипции новые участки инициации. Было показано, что такая стимуляция транскрипции специфична к определенным промоторам и уровень ее сильно колеблется. Кроме того, очевидно, что уровень стимуляции зависит от ряда условий, в том числе температуры, ионной силы и соотношения полимеразы и ДНК [16]. За введение отрицательных сверхвитков в кольцевые молекулы ДНК ответствен фермент ДНК-гираза '[17]. Он состоит из двух субъединиц — продуктов генов gyrA и gyrB. ЭЗО-экстракт содержит значительную активность гиразы, и релаксированные кова-лентно-замкнутые ДНК при инкубации в этом экстракте быстро подвергаются сверхспирализации. Раскручивание ДНК для удаления сверхвитков осуществляет фермент топоизомераза I [17], но его активность низка по сравнению с активностью гиразы. Во время инкубации в БЗО-экстракте кольцевые молекулы ДНК находятся в сверхспиральной форме, тогда как линейные ДНК не могут быть сверхспиральными. Если сверхспирализация необходима для эффективной инициации транскрипции на некоторых промоторах, то этот фактор может оказаться лимитирующим при использовании линейных фрагментов ДНК в качестве матриц в системах in vitro: можно не найти гены, промоторы которых нуждаются в сверхспирализации для экспрессии, а исследования регуляции экспрессии генов in vitro могут не иметь никакого отношения к ситуации in vivo.

Один из способов изучения вклада сверхспирализации в эффективность транскрипции состоит в сравнении экспрессии

Прокариотические бесклеточные системы транскрипции — трансляции 245

сверхспиральной и релаксированной ковалентно-замкнутой форм одной и той же молекулы. При инкубации в присутствии БЗО-экстракта релаксированные плазмидные ДНК быстро сверх-спирализуются, но эту сверхспирализацию можно подавить одним из специфических ингибиторов гиразы [15]. С помощью этого подхода Янг и др. [15] продемонстрировали существенное снижение экспрессии ряда генов, в том числе генов, кодирующих колицин Е1 и ?-галактозидазу в отсутствие сверхспирализации. Подобные эксперименты были проведены и с использованием БЗО-экстракта, полученного из мутантных по ДНК-гира-зе клеток [5]. Релаксированную и сверхспиральную формы плазмиды ColEl инкубировали по отдельности в присутствии экстракта и затем проверяли, какие топологические изменения возникали в ДНК. ДНК оставалась в этих случаях полностью релаксированной и полностью сверхспиральной соответственно. Анализ продуктов генов ясно показал, что, в противоречии с данными Янга и др. [15], конформация ДНК не оказывает никакого избирательного действия на экспрессию каких-либо генов плазмиды ColEl. Анализ релаксированной и сверхспиральной форм плазмиды pBR325 в БЗО-экстракте из клеток, мутантных по гиразе, свидетельствует о том, что в отсутствие сверхспи

страница 55
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88

Скачать книгу "Транскрипция и трансляция. Методы" (6.57Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(07.12.2019)