ый объем ТЭ-буфера (10 мМ трис-HCl, рН 7,5, 1 мМ ЭДТА), чтобы разбавить CsCl. Затем добавьте равный объем фенольной смеси1 и как следует перемешайте.

5. Отцентрифугируйте 20 мин при 16 OOOgf при 8 °С (например, в роторе

Sorvall НВ4 при 10 000 об/мин).

6. Перенесите водный слой в чистую центрифужную пробирку и повторите фенольную экстракцию.

7. Диализуйте водный слой против нескольких смен ТЭ-буфера.

8. После диализа добавьте 3,0 ? ацетат натрия, рН 5,6, до концентрации 0,3 ? и два объема этанола. Хорошо перемешайте и оставьте на 1 ч при — 70 °С.

9. Отцентрифугируйте 30 мин при 16 000g- при —10 °С (например, в потопе Sorvall НВ4 при 10 000 об/мин). 1 1

10. Подсушите осадок фаговой ДНК под вакуумом. Ресуспендируйте осадок в небольшом объеме ТЭ-буфера в концентрации 200—500 мкг/мл и храните при —20 °С.

1 Состав фенольной смеси см. в сноске 4 к табл. 8.

тифицировать продукты любых генов, клонированных вместе со своими промоторами. Для их экспрессии можно также использовать промотор вектора. Пример такой идентификации продуктов приведен на рис. 4. В стандартной серии проб в качестве матриц использовали ДНК плазмид pBR325 и pLG281 (разд. 2.5.2). Плазмида pLG281 представляет собой плазмиду pBR325, несущую fcoRI-фрагмент плазмиды Collb, кодирующий образование колицина I. В системе Зьюби происходит синтез полипептидов, кодируемых вектором pBR325—CAT и ???-?-лак-тамазы (?-lac*). Анализ полипептидов приведен на дорожке 4 рис. 4. Обратите внимание, что при этой экспозиции ???-?-лак-тамаза практически не видна. На дорожке 3 (pLG281 в системе Зьюби) видно, что ген CAT был инактивирован при клонировании; как и ожидалось, видна пре-^-лактамаза, а также новый полипептид с мол. массой —68 кДа (белок колицин I). На дорожке 2 показан анализ pLG281 в системе экспрессии в мини-клетках E.coliDS410 (гл. 6, разд. 3). Как видно, молекулярные массы белка колицина 1, синтезированного in vitro (дорожка 3), и белка, синтезированного в условиях, близких к прижизненным (мини-клетки, дорожка 2),совпадают. Это показывает,что колицин I не синтезируется в виде предшественника (разд. 4.3).

236

Глава 7

КолицинI

Рис. 4. Идентификация продуктов клонированных генов. Продукты, кодируемые плазмидными генами, метили в мини-клетках Е. coli DS410 (дорожки 1 и 2; гл. 6) или in vitro в системе Зьюби (дорожки 3—5; настоящая глава, разд. 2) и анализировали с помощью электрофореза в 11%-ном ПАГГ—ДСН и радиоавтографии. Дорожка 1—мини-клетки DS410 (без плазмиды); дорожка 2 — мини-клетки DS410, несущие плазмиду pLG281. Дорожки Зи4 — плазмиды pLG281 и pBR325 соответственно в системе Зьюби. Дорожка 5 — контрольная проба системы Зьюби (без ДНК). Обозначения: ?-lac — ?-лак-тамаза; ?-lac* — предшественник ?-лактамазы; CAT — хлорамфениколацетил-трансфераза. Все эти белки, включая колицин I, описаны в разд. 4.2. Пре-?-лактамаза имеется и на дорожке 4, но ее трудно увидеть при этой экспозиции.

Прокариотические бесклеточные системы транскрипции — трансляции 237

4.3. Идентификация предшественников белков

Многие мембранные белки синтезируются в виде предшественников с дополнительными гидрофобными участками на ?-конце (сигнальными последовательностями). Впоследствии эти участки удаляются при включении белков в мембрану или прохождении через нее [8]. Система синтеза in vitro Зьюби содержит фрагменты мембраны, но они неактивны в качестве акцепторов новосинтезированных мембранных белков. В системе Голда и Швейгера вообще не содержится мембран. Поэтому обе эти системы можно использовать для идентификации предшественников белков. Здесь возможны два подхода. Во-первых, мож-

Таблица 15. Идентификация предшественников белков с помощью фракции мембранных везикул

Выделение мембранных везикул1*-

1. Вырастите 4—6 л культуры клеток в питательном бульоне [2,5% (вес/объем) сухого питательного бульона в воде] до Лбоо=0,5.

2. Соберите клетки центрифугированием в течение 10 мин при 3000g при 4 °С. Промойте клетки, отцентрифугировав их в ледяном буфере А (1 мМ ДТТ, 5 мМ ацетат магния, 50 мМ трис-HCl, рН 7,5).

3. Ресуспендируйте промытые клетки в 40 мл буфера А и разрушьте их во френч-прессе при 210 атм.

4. Отцентрифугируйте разрушенные клетки 10 мин при 10 OOOgf при 4 °С.

5. Отберите супернатант и наслоите его порциями по 8 мл на 2 мл 20%-ной (вес/объем) сахарозы в буфере А. Отцентрифугируйте 1 ч при 100 OOOg при 4°С.

6. Слейте супернатант и ресуспендируйте осадок в небольшом объеме буфера А. Наслоите этот материал поверх двух линейных градиентов сахарозы (20—50% (вес/объем)], приготовленных на буфере А. Отцентрифугируйте в бакет-роторе 20 ч при 180 OOOg при 4 °С.

7. Отберите зону мутного материала в области 35—45% сахарозы и разведите равным объемом буфера А.

S. Отцентрифугируйте 1 ч при 100 000g при 4 °С.

9. Ресуспендируйте осадок в буфере Б (1 мМ ДТТ, 10 мМ ЭДТА, 50 мМ трис-HCl, рН 7,5), так чтобы концентрация соответствовала Л28о=102.

10. Наслоите материал порциями по 8 мл на 2 мл 20%-ной (вес/объем) сахарозы в буфере А. Отцентрифугируйте 2 ч при 100 000g при 4 °С.

11. Ресуспендируйте осадок в буфере А (конечная концентрация соответствует Л28о = 75) и храните отдельными порциями при —70 °С.

Использование фракции мембранных везикул

При добавлении фракции мембранных везикул в систему Зьюби наблюдается существенное подавление синтеза белка (в 3—15 раз). Поэтому следует эмпирически подобрать такое количество фракции мембранных везикул, чтобы происходил процессинг белка и достаточно интенсивно шел его синтез. Используйте несколько объемов везикул, от 0,5 до 5 мкл на 30 мкл реакционной смеси. Для уточнения оптимальных условий проанализируйте продукты с помощью электрофореза в ПААГ—ДСН.

1 По Чангу и др. [11], которые использовали в качестве источника везикул штамм Е. coli ML30.

2 Чтобы определить Л28о, разведите небольшую аликвоту образца в 3%-ном ДСН при 25 "С перемешайте и измерьте оптическую плотность.

238

Глава 7

-лейС(105 к}

Рис. 5. Идентификация предшественников белков путем сравнения продуктов синтеза in vivo и in vitro. Показана флюорография полипептидов, меченных [355]-метионином, после электрофореза в 11%-ном ПААГ—ДСН. Дорожка 1 — аутентичные пенициллинсвязывающие белки (РВР), меченные [14С]-бензилпе-нициллином; дорожка 2 — экспрессия фага XBSIO (фаг ?, несущий гены pbpA, rodA, leuS и dacA [8]) в системе Зьюби in vitro; дорожка 3 — экспрессия XpBSlO в системе с использованием УФ-облученных клеток-хозяев (гл. 6). При инкубации in vitro экспрессируются не только клонированные гены, но также некоторые гены самого фага ?, поскольку система не содержит репрессорных белков, способных подавить транскрипцию с промоторов фага ?. В системе УФ-облученных клеток-хозяев репрессор имеется и экспрессия фаговых генов подавлена (гл. 6, разд. 2). Обозначения: лей С — лей-цил-тРНК — синтетаза, РВР5 и РВР6 — пенициллинсвязывающие белки 5 и 6; РВР5* — предшественник РВР5.

Прокариотические бесклеточные системы транскрипции — трансляции 239

1 2 3 4

Рис. 6. Идентификация предшественников белков с помощью мембранных везикул. Приведена радиоавтограмма полипептидов, меченных [355]-метиони-ном, после электрофореза в 11%-ном ПААГ —ДСН. Конструирование плазмиды pLG310 описано в подписи к рис. 9. Дорожка 1—мини-клетки DS410, несущие плазмиду pLG310; дорожка 3 — экспрессия pLG310 in vitro; дорожка 2 —экспрессия pLG310 in vitro в присутствии вывернутых везикул внутренней мембраны Е. coli; дорожка 4 — белки РВР, меченные [14С]-бензилпе-«ициллином. Отмечено положение РВР6. Обозначения ?-lac и РВР6 относятся к ?-лактамазе и пенициллинсвязывающему белку 6 соответственно, а ?-lac* и РВР6* —к молекулам их предшественников. In vitro синтезируется предшественник РВР6 (дорожка 3), а затем в присутствии фракции мембранных везикул он превращается в зрелый белок (дорожка 2).

240

Глава 7

но исследовать одну и ту же плазмидную или фаговую ДНК в системе in vitro и в одной из систем экспрессии генов in vivo (см. гл. 6) и сравнить спектры синтезированных полипептидов. Если предшественник существует, он должен быть больше зрелого полипептида и должен выявляться при синтезе in vitro, но не in vivo, когда он процессируется до зрелого полипептида. Можно привести два примера [9, 10]: предшественник ?-лакта-мазы (?-lac*) (ср. дорожки 2 и 3 на рис. 4) и предшественник пенициллинсвязывающего белка 5 (РВР5*) — продукта гена dacA (ср. дорожки 2 и 3 на рис. 5). Другой подход заключается в том, чтобы добавить в систему in vitro экзогенные мембранные везикулы, способные акцептировать предшественники полипептидов и процессировать их до зрелых продуктов. При этом сравнение полипептидов, синтезированных in vitro в присутствии и в отсутствие мембранных везикул, позволяет идентифицировать белки, которые синтезируются в виде предшественников. Так был идентифицирован предшественник пенициллинсвязывающего белка 6 (РВР6*)—продукт гена dacC [9] (рис. 6). В табл. 15 описаны выделение фракции мембранных везикул и их использование для этой цели.

4.4. Исследование регуляции экспрессии генов

Очевидно, система in vitro особенно удобна для изучения влияния различных компонентов на эффективность экспрессии. Действительно, во множестве работ были получены важные данные такого рода [1]. Однако, поскольку эффективность синтеза белка в сопряженной системе зависит от образования посредника— мРНК, очень важно, чтобы в экстракте практически не было рибонуклеазной активности, которая может заметно влиять на результаты изучения регуляции экспрессии генов. Именно по этой причине в качестве источника ЭЗО-экстракта обычно используют штамм MRE600, в котором отсутствует основная ри-бонуклеазная активность Е. coli. Вместе с тем активные экстракты были получены и из ряда штаммов, содержащих РНКазы, в том числе из KN126 [5], N138recBts [12] и LE316 [5], в которых эндогенная РНКазная активность Е. coli сравнительно низка, по крайней мере в условиях реакции. Вероятно, активный экстракт можно получить из любого мутантного штамма Е. coli. Затем этот экстракт можно использовать в качестве те