sCl или разбавляя раствор.

* Фенольная смесь состоит из 100 г фенола, 4 мл изоамилового спирта, ОД г 8-гидр-оксихинолина и 100 мл хлороформа. Такую фенольную смесь хранят под 10 мМ трис-НС1, рН 7,5, при 4 °С.

2.5.2. Определение оптимальных концентраций ионов магния и 530-экстракта

Наш опыт показывает, что, каким бы методом ни была выделена плазмидная ДНК, важно, чтобы она не была загрязнена РНКазой, хлоридом цезия, этанолом, агарозой или большим количеством солей. Эти, казалось бы очевидные, требования нужно всегда иметь в виду, поскольку именно примеси в препарате ДНК обычно подавляют ее активность в качестве матрицы при

Прокариотические бесклеточные системы транскрипции — трансляции 225

Таблица 9. Определение оптимальной концентрации ионов магния1

Объем мкл № пробирки ДНК2 [35S]- метионин НМ-смесь 0,1 ? ацетат магния ТА-буфер ТЭ-буфер S30-экстракт*

1 5,0 2,0 7,5 2,0 8,5 _ 5,0

2 5,0 2,0 7,5 2,5 8,0 .— 5,0

3 5,0 2,0 7,5 3,0 7,5 — 5,0

4 5,0 2,0 7,5 3,5 7,0 .— 5,0

5 5,0 2,0 7,5 4,0 6,5 — 5,0

6 —. 2,0 7,5 3,5 2,0 5,0 5,0

7 5,0 2,0 7,5 2,5 5,0 — 8,0

8 5,0 2,0 7,5 3,5 4,0 —. 8,0

9 — 2,0 7,5 3,5 — 4,0 8,0

1 Состав компонентов, за исключением раствора ДНК и ЭЗО-экстракта, приведен в табл. 2—5.

2 Раствор плазмидной ДНК (например, pBR325) в ТЭ-буфере в концентрации 300— 500 мкг/мл.

3 Приготовление экстракта описано в разд. 2.4.

инкубации in vitro. Как правило, эту проблему можно решить с помощью нескольких экстракций фенолом, осаждения этанолом и диализа.

Как показывает наш опыт, оптимальная концентрация магния для синтеза белка в системе Зьюби составляет 10—15 мМ. Более точно эту концентрацию определяют для данного препа-

Таблица 10. Определение включения радиоактивности в белок

Данная методика позволяет обрабатывать одновременно много образцов в одинаковых условиях и дает весьма воспроизводимые результаты.

1. Нанесите 2—5 мкл из каждой радиоактивной пробы на отдельный кружок фильтрованной бумаги Whatman 3 ММ, пронумерованный карандашом. Подсушите при комнатной температуре.

2. Погрузите фильтры по одному в 200 мл ледяной 10%-ной ТХУ, содержащей 0,1% метионина. Оставьте их во льду на 1 ч, время от времени встряхивая.

3. Перенесите фильтры в 200 мл 5%-ной ТХУ, содержащей 0,1% метионина. Инкубируйте 10 мин при 90 °С.

4. Слейте ТХУ и залейте 200 мл свежего раствора 5%-ной ТХУ, 0,1 %-ного метионина.

5. Меняйте смесь ТХУ — метионин каждые 15 мин (3—4 смены).

6. Слейте ТХУ и залейте фильтры минимальным количеством ацетона, чтобы он только покрыл их. Встряхните и слейте ацетон.

7. Налейте свежую порцию ацетона и оставьте при комнатной температуре на 10 мин.

8. Выньте фильтры пинцетом по одному и подсушите при комнатной температуре.

9. Поместите каждый фильтр в отдельную кювету для измерения радиоактивности, залейте сцинтилляционную жидкость и просчитайте на счетчике.

15-953

226

Глава 7

Рис. 1. ТХУ-нерастворимая радиоактивность в пробах 1—5 опыта по определению оптимальной концентрации магния (табл. 9). В качестве матрицы использовали ДНК плазмиды pBR325 в концентрации 300 мкг/мл.

О 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 Количество 0,1 ? ацетата магния,мкл/пробу

рата экстракта, изменяя концентрацию ионов магния и проверяя включение радиоактивности в аликвотах в ТХУ-нераствори-мую фракцию. Иногда приходится также определить оптимальную концентрацию 530-экстракта. В табл. 9 приведены результаты типичного опыта по определению оптимальных концентраций ионов магния и БЗО-экстракта. Пробы 1—6 предназначены для определения оптимальных концентраций магния (проба 6 — контроль, не содержащий ДНК), а пробы 7—9 позволяют проверить влияние увеличения концентрации 530-экстракта (проба 9 также представляет собой контроль без ДНК). Опыт ставят следующим образом.

1. Добавьте указанное в табл. 9 количество [355]-метионина, НМ-смеси, ТА-буфера, ТЭ-буфера, ацетата магния и ДНК в пронумерованные стерильные микроцентрифужные пробирки во льду.

2. Отцентрифугируйте пробирки 15 с в микроцентрнфуге, чтобы собрать все компоненты на дне пробирок.

3. Предынкубируйте пробирки 2—4 мин в водяной бане со встряхивателем при 37 °С.

4. В каждую пробирку добавьте БЗО-экстракт, тщательно перемешивая смесь кончиком для микропипетки (в каждой пробе своим). Поставьте пробирки обратно в водяную баню.

5. После добавления БЗО-экстракта во все пробирки продолжайте инкубацию при 37 °С в течение 30—60 мин, встряхивая пробирки как можно интенсивнее, чтобы их содержимое как

Прокариотические бесклеточные системы транскрипции — трансляции 227

следует перемешивалось. Это необходимо для хорошего включения [1, 6].

6. Добавьте в каждую пробирку по 10 мкл предварительно нагретого (37 °С) немеченого L-метионина (8 мг/мл в воде, обработанной ДЭПК), перемешайте и инкубируйте еще 5 мин, чтобы завершить синтез меченых полипептидов.

7. Перенесите пробирки в лед. Через 10 мин быстро перемешайте содержимое каждой пробирки встряхиванием. Нанесите .аликвоты (2—5 мкл) на пронумерованные кружки фильтровальной бумаги Whatman ЗММ для определения включения [35S]-метионина в белки. Эта процедура описана в табл. 10. Результаты типичного эксперимента показаны на рис. 1: при добавлении 3,5 мкл 0,1 ? ацетата магния на стандартный объем инкубационной смеси наблюдали оптимальное включение [35S]-метионина в белок, т. е. оптимальная концентрация магния составила 11,7 мМ.

8. Добавьте к остальной инкубационной смеси 30 мкл ТА-буфера и 30 мкл 20%-ного глицерола, 2%-ного ДСН, 5%-ного 2-меркаптоэтанола, 0,001 %-ного (вес/объем) бромфенолового синего, 0,125 ? трис-HCl рН 6,8.

9. Прокипятите образцы 3 мин и проанализируйте меченые полипептиды электрофорезом в ПААГ — ДСН, нанося не более 50 мкл каждого образца в ячейку.

На рис. 2 (дорожки 1—6) показан результат электрофореза © ПААГ — ДСН образцов, полученных в эксперименте по определению оптимальной концентрации магния (рис. 1). Видно, что в этом опыте добавление 3,5 мкл 0,1 ? ацетата магния на стандартную инкубационную смесь дает максимальное включение [35S]-метионина в полипептидные продукты. Однако следует отметить, что оптимальные значения концентрации магния, полученные по определению ТХУ-нерастворимой метки и по электрофорезу в ПААГ —ДСН, не всегда совпадают. Например, максимальное включение в ТХУ-нерастворимые продукты иногда является результатом нарушения правильности транскрипции, так как высокая концентрация ионов магния облегчает инициацию транскрипции не только в правильных местах, но и на таких участках, которые в норме не используются. В результате образуются транскрипты, которые дают при трансляции неправильные полипептиды; при этом наблюдается повышенное включение в ТХУ-нерастворимую фракцию, но электрофорез в ПААГ — ДСН дает аномальный спектр полипептидов. Кроме того, при высокой концентрации ионов магния нарушается правильность трансляции, так как происходит инициация этого процесса на новых участках помимо правильных мест инициации; это также приводит к повышенному включению метки, по аномальному спектру белков. Пример такого расхождения между данными

8 5*

228

Глава 7

Рис. 2. Анализ полипептидов, синтезированных в различных пробах опыта по определению оптимальной концентрации магния (рис. 1), с помощью электрофореза в 15%-ном пластинчатом ПААГ—ДСН и радиоавтографии. Дорожки 1—9 соответствуют пробам 1—9 в табл. 9. Полипептидные продукты, синтезирующиеся с использованием в качестве матрицы ДНК плазмиды pBR325, — предшественник ?-лактамазы (?-lac*) и хлорамфениколацетил-

трансфераза (CAT).

по ТХУ-нерастворимой радиоактивности и электрофорезом показан на рис. 1 и 2. Хотя, судя по ТХУ-нерастворимой радиоактивности, включение в пробы 1 и 2 одинаково (рис. 1), радиоактивность в первом из этих образцов, судя по рис. 2, включилась в низкомолекулярные пептиды, слишком короткие, чтобы их можно было увидеть при электрофорезе в ПААГ—ДСН, но достаточно длинные, чтобы они осаждались ТХУ. Во всех случаях, когда наблюдается такое расхождение, решающим критерием при выборе концентрации ионов магния является именно электрофорез в ПААГ — ДСН.

Фоновое включение i[35S]-метионина в ЭЗО-экстракте, которое определяют по ТХУ-нерастворимой радиоактивности в контроль-

Прокариотические бесклеточные системы транскрипции — трансляции 229

30 40 50 Время, мин

Рис. 3. Кинетика включения [355]-метионина в полипептиды in vitro. Реакцию проводили с использованием в качестве матрицы 2 мкг ДНК плазмиды pBR325 в присутствии БЗО-экстракта из клеток Е. coli MRE600.

ной пробе, не содержащей плазмидной ДНК (табл. 9, проба 6), варьирует в зависимости от концентрации ионов магния. Но при насыщающих концентрациях ДНК стимуляция включения по сравнению с контролем должна достигать 40—60 раз. Если экстракт дает более чем 10-кратную стимуляцию, этого обычно достаточно для получения вполне приемлемых результатов. Естественно, в контрольной смеси не должно быть кодируемых плазмидой полипептидов при анализе в ПААГ — ДСН (рис. 2, дорожка 6).

На рис. 2, дорожки 7—9, приведены результаты анализа проб 7—9 (табл. 9) с помощью электрофореза в ПААГ — ДСН. Если сопоставить их с дорожками 2 и 4 того же рисунка, то видно, что для максимального синтеза полипептидов с имеющейся в смеси матрицы 5 мкл ЭЗО-экстракта достаточно. Следует отметить, что при увеличении количества ЭЗО-экстракта включение часто падает.

2.5.3. Кинетика включения метки

После определения оптимальных концентраций магния и ЭЗО-экстракта в системе следует построить кривую зависимости включения метки от времени.

1. Приготовьте инкубационную смесь вдвое большего объема, чем обычно (т. е. 60 мкл), и отбирайте аликвоты по 2 мкл.

230

Глава 7

на пронумерованные кружки фильтровальной бумаги Whatman ЗММ через различные промежутки времени.

2. Высушите фильтры, осадите меченые полипептидные продукты ТХУ, промойте фильтры и определите радиоактивность, ка