0,42 ? фосфоенолпируват, рН 7,0 Смесь аминокислот Б (без метионина)

40%-ный ПЭГ-6000 Фолиевая кислота (2,7 мг/мл) 50 мМ 3', 5'-сАМР, рН 7,0 тРНК (17,4 мг/мл) Исходный раствор солей:

1,4 ? ацетат аммония

2,8 ? ацетат калия

0,38 ? ацетат кальция Смешайте компоненты в указанном порядке, по 100 мкл и храните их при — 20 °С. При храняет активность не менее 2—3 мес

40 5 50

15

100 10

75 20 20 15

40

56,4 мМ 1,76 мМ 1,22 мМ

0,85 мМ

27,0 мМ 0,35 мМ

1,9%

34,6 мкг/мл 0,64 мМ 0,17 мг'мл

36,0 мМ 72,0 мМ 9,7 мМ

разделите раствор на аликвоты этой температуре НМ-смесь со-

Прокариотические бесклеточные системы транскрипции — трансляции 221

Таблица 6. Приготовление неполной богатой среды

КН2Р04 56 г

К2НРО4 289 г

Дрожжевой экстракт 10 г

Тиамин 15 мг

Каждая из необходимых аминокислот1 0,5 г Дистиллированная вода до 10 л

Проавтоклавируйте среду 45 мин при 1 атм.

1 Клетки Е. coli MRE600 не нуждаются ни в каких аминокислотах.

5. Во время инкубации интенсивно аэрируйте культуру встряхиванием или пропусканием через ферментер протока воздуха, пока Л450 не достигнет 1,5—2,0 (обычно культуру растят в течение ночи).

6. В день опыта приготовьте буфер для промывки клеток (530-буфер), смешав по 10 мл следующих исходных растворов (табл. 3): 1,4 ? ацетата магния; 6,0 ? ацетата калия; 0,1 ? ДТТ; 1,0М трис-ацетата, рН 8,2. Затем добавьте воду, обработанную ДЭПК, до 1 л и храните буфер при +4°С.

7. Соберите клетки центрифугированием при 10 000 g в течение 15 мин при 4 °С.

8. Промойте клетки 3 раза 500 мл охлажденного 530-буфера с добавлением 0,5 мл 2-меркаптоэтанола на 1 л и определите вес сырой массы клеток.

9. Храните клетки в виде осадка при —70 °С не дольше 1— 2 дней.

2.4. Получение 830-экстракта

1. Тщательно очистите рабочую камеру френч-пресса (лучше это сделать накануне эксперимента). Промойте детали камеры водой, обработанной ДЭПК, и присоедините кусок гибкого шланга длиной около 60 см к боковому отводу. Соберите ячейку и наполните ее водой, обработанной ДЭПК. Прикройте ячейку и шланг фольгой и храните при +4 °С.

2. В день получения ЭЗО-экстракта приготовьте свежий ЭЗО-буфер, как описано в разд. 2.3, стадия 6.

3. Достаньте осадок клеток (разд. 2.3, стадия 9) из холодильника на —70 °С и дайте ему оттаять в течение 30—60 мин при ,+ 4°С.

4. Медленно ресуспендируйте клетки в 830-буфере, содержащем 2-меркаптоэтанол (0,05 мл/л), из расчета 100 мл буфера на 10 г клеток.

5. Отцентрифугируйте суспензию 30 мин при 16 000 g при 4°С и взвесьте осадок.

222

Глава 7

6. Тщательно ресуспендируйте клетки. Для этого поместите их в колбу Бюхнера и добавьте 63,5 мл БЗО-буфера на 50 г клеток. Присоедините колбу резиновым шлангом к вакуумному насосу и закройте ее резиновой пробкой. Откачайте воздух из колбы. Выньте пробку и суспендируйте клетки, помешивая их теф-лоновым пестиком из гомогенизатора. Через небольшие промежутки времени откачивайте воздух из колбы, чтобы ресуспенди-ровать клетки по возможности в анаэробных условиях. Важно разбить комочки клеток. Обычно это легко сделать, просто помешивая пестиком суспензию клеток и раздавливая комочки. Вместе с тем клетки некоторых штаммов, например гесВи, иногда очень трудно ресуспендировать. Тогда приходится очень осторожно гомогенизировать их в гомогенизаторе с большим зазором. Однако к гомогенизации желательно по возможности не прибегать.

7. Измерьте объем ресуспендированных клеток и перенесите HxjB лед. Залейте клетки в рабочую ячейку френч-пресса пипеткой на 10 мл, стараясь не внести туда большие комки клеток. Следите за тем, чтобы в камере не появлялись пузыри воздуха.

8. Пропустите клетки через пресс при давлении ~590 атм. и соберите лизат во льду. Добавьте 100 мкл 0,1 ? ДТТ на 10 мл собранного лизата. На этой стадии препарат может быть еще вязким и мутным. Оставшиеся целые клетки удаляют при последующем центрифугировании. Повторно пропускать материал через френч-пресс для более полного разрушения клеток не рекомендуется, так как это приводит к потере активности.

9. Немедленно отцентрифугируйте препарат в течение 30 мин при 30 000g при 4 °С. Тем временем нагрейте водяной термоста-тируемый встряхиватель с вращающейся платформой до 37 °С. Разморозьте растворы, необходимые для приготовления среды для предынкубации (табл. 7).

10. После центрифугирования (стадия 9) перенесите верхние 4/ь супернатанта в чистую пробирку. Определите объем суперна-

Таблица 7. Приготовление смеси для предынкубации1

Смешайте следующие исходные растворы2:

Пируваткиназа 25 мкл

2,2 ? трис-ацетат, рН 8,2 1,0 мл

3,0 ? ацетат магния 23 мкл

38 мМ АТР, рН 7,0 2,6 мл

0,42 ? фосфоенолпируват, рН 7,0 1,5 мл

0,55 ? ДТТ 60 мкл Смесь аминокислот А 6 мкл

Дистиллированная вода, обработанная ДЭПК, до 7,5 мл

' Смесь для предынкубации готовят непосредственно перед использованием. Состав исходных растворов приведен в табл. 2—4.

Прокариотические бесклеточные системы транскрипции — трансляции 223

танта и снова отцентрифугируйте его 30 мин при 30 000 g при 4°С. Тем временем приготовьте 7,5 мл среды для предынкубации (табл. 7) на каждые 25 мл супернатанта.

11. После центрифугирования (п. 10) перенесите верхние 4/б супернатанта в небольшую коническую колбу. Измерьте объем и добавьте 7,5 мл среды для предынкубации на каждые 25 мл супернатанта. Накройте колбу фольгой и инкубируйте ее, осторожно покачивая на водяной бане (или в воздушном термостате с вращающейся платформой) 80 мин при 37 °С (или 160 мин при 30 °С в случае температурочувствительных штаммов; разд. 5.1.1).

12. Поместите смесь в подготовленные трубки для диализа (разд. 2.2) и диализуйте против 50 объемов ЭЗО-буфера при 4°С. Трижды смените ЭЗО-буфер, диализуя по 45 мин против каждой смены.

13. Центрифугируйте экстракт 10 мин при 4000 g при 4°С. Разделите супернатант на аликвоты по 0,5—2 мл и храните их в жидком азоте. Если за контейнером с жидким азотом постоянно следить, эти экстракты будут давать воспроизводимую активность в течение многих лет.

2.5. Оптимизация системы

2.5.1. Выделение плазмидной ДНК

Для оптимизации системы необходимо примерно 50 мкг плазмидной ДНК. Обычно мы проверяем активность вновь приготовленных экстрактов с многокопийной плазмидой pBR325. Ее преимущество состоит в том, что она дает два легко идентифицируемых продукта — ?-лактамазу и хлорамфениколацетил-трансферазу (CAT). Однако может оказаться подходящей и любая другая многокопийная плазмида, например pBR322, рАТ153, pACYC184. Надежная методика выделения плазмидной ДНК приведена в табл. 8.

Таблица 8. Выделение плазмидной ДНК _

1. Вырастите 400 мл культуры бактерии-хозяина в питательном бульоне (2,5% сухого питательного бульона в воде), содержащем необходимые антибиотики, до поздней логарифмической фазы (например, до Л45о-0,8)

2. Добавьте хлорамфеникол (170 мкг/мл) или спектиномицин (300 мкг/мл) для амплификации плазмиды и продолжайте инкубацию при 37 °С в течение ночи1. „

3. Охлаждайте клетки 10 мин при 4 "С. Затем отцентрифугируйте их^ 10 мин при 4000g при 4°С (например, в роторе Sorvall GS3 при 5000 об/мин).

4 Промойте клетки центрифугированием в 40 мл бактериального буфера (20 мМ КН2Р04) 50 мМ Na2HP04, 70 мМ NaCl, 40 мкМ MgSO„, рН 7,0).

5. Ресуспендируйте клетки в 3 мл 25%-ной сахарозы, 50 мМ трис-НС1, рН 8,0, и затем добавьте 0,5 мл смеси лизоцима (10 мг/мл) и РНКазы (300 мкг/мл).

224

Глава 7

6 Проинкубируйте 5 мин при комнатной температуре. Затем добавьте 4 мл 2%-ного (по весу) тритона Х-100, 50 мМ трис-HCl, рН 8,0, и ^перевер-ните пробирку с клетками несколько раз, пока не пройдет полный лизис.

7. Отцентрифугируйте 20 мин при 39 000g при 4°С (например в роторе Sorvall SS34 при 18 000 об/мин).

8. Слейте супернатант в поликарбонатную пробирку и добавьте 2/з объема 1,25 ? NaCl, 25%-ного (вес/объем) ПЭГ (мол. масса 6000). Оставьте во льду не менее чем на 1 ч.

9. Отцентрифугируйте 10 мин при 4000g при 4 °С (например, в роторе Sorvall НВ4 при 5000 об/мин).

10. Ресуспендируйте осадок в объеме точно 1,1 мл 5 мМ ЭДТА, 50 мМ NaCl, 50 мМ трис-HCl, рН 8,0, и перенесите раствор в пробирку вертикального ротора Beckman VTi 652. Подслоите под образец 4 мл раствора CsCl, содержащего бромистый этидий3, и заплавьте пробирку. Отцентрифугируйте 3 ч при 300 000g- или в течение ночи при 230 000g при 15 °С (ротор VTi65, 55 000 или 50 000 об/мин соответственно).

11. После центрифугирования найдите полосы ДНК, осветив пробирку УФ-светом. Отберите полосу плазмидной ДНК, проткнув стенку сбоку шприцем. Удалите бромистый этидий эстракцией изопропанолом, насыщенным CsCl.

12. Диализуйте препарат плазмидной ДНК против трех смен ТЭ-буфера (10 мМ трис, рН 7,5, 1 мМ ЭДТА).

13. Перенесите раствор ДНК в силиконированную стеклянную (Согех) центрифужную пробирку. Добавьте ЗМ ацетат натрия, рН 5,6 до 0,3 М, а затем 2,5 объема этанола. Оставьте на 3—4 ч при —20 °С.

14. Отцентрифугируйте плазмидную ДНК 10 мин при 16 000g при —10 °С (например, в роторе Sorvall НВ4 при 10 000 об/мин).

15. Высушите осадок ДНК под вакуумом. Ресуспендируйте осадок в 1 мл ТЭ-буфера и экстрагируйте раствор дважды равным объемом фенольной смеси4.

16. Дважды экстрагируйте препарат диэтиловым эфиром, чтобы удалить остатки фенола, а затем осадите плазмидную ДНК из водной фазы, как описано в пп. 13 и 14.

17. Ресуспендируйте плазмидную ДНК в ТЭ-буфере в концентрации 200— 500 мкг/мл.

1 Если плазмида не может амплифицироваться, выделяйте ее из 400 мл культуры ¦клеток-хозяев, выращенных в течение ночи при 37 "С

2 При соблюдении соотношения объемов раствора ДНК и раствора CsCl с бромистым этидием общий объем можно менять, чтобы он подходил к имеющимся центрифужным пробиркам и роторам. Например, можно проводить центрифугирование при 82 000 g течение 40 ч в роторе Beckman 50Ti (скорость 30 000 об/мин).

3 Раствор готовят следующим образом. Смешайте 80 г CsCl, 8 мл раствора бромистого этндия (5 мг/мл) и 52 мл 5 мМ ЭДТА, 50 мМ NaCl, 50 мМ трис-HCl, рН 8,0. Если это необходимо, доведите показатель преломления до 1,3990—1,4000, добавляя C