Биологический каталог




Транскрипция и трансляция. Методы

Автор Б.Хеймс, С.Хиггинс

и к включению и экспрессии экзогенной ДНК; заметно

22

Глава 1

Рис. 4. Кривые «доза — ответ» для трансформации плазмидой рТК1. Реципиентами служили клетки мыши LATK- (/), сирийского хомячка ВНКТК-(II), крысы 4ТК~ (Ш), китайского хомячка СНОТК- (/V), человека 143ТК" (V), эритролейкемические клетки мыши F4-12B2TK- (VI). В каждом случае конечная концентрация ДНК на этапе соосаждения с фосфатом кальция составляла 20 мкг/мл. Поэтому, если рекомбинантной ДНК было не более 1 мкг, в смесь добавляли ДНК спермы лосося в качестве носителя. Каждая точка отвечает среднему числу резистентных к HAT колоний на флакон по данным для 4—8 флаконов.

различается у них и эффективность трансформации. Эти эффекты наблюдались даже для разных клонов, выделенных из одной и той же линии клеток.

2.1.7. Вещества, повышающие эффективность трансформации

Известно несколько химических «усилителей» экспрессии донорной ДНК в реципиентных клетках [2, 11 —13]. В табл. 6 перечислены такие вещества, повышающие эффективность трансформации различных клеточных линий. «Усилитель» обычно добавляют через 4—8 ч после абсорбции копреципитата ДНК — фосфат кальция. Некоторые вещества, такие, как ДМСО, значительно увеличивают уровень экспрессии экзогенной ДНК в одних клетках, но проявляют токсический эффект в отношении других. Оптимальную концентрацию «усилителя», оптимальное время обработки им клеток и время после трансфекции следует эмпирически определять для каждого нового вещества, повышающего эффективность трансформации, и для каждой новой клеточной линии. Типичные кривые, иллюстрирующие влияние ДМСО на инфекционность ДНК HSV, приведены на рис. 5.

Экспрессия экзогенной ДНК в клетках млекопитающих

23

Таблица 6. Вещества, повышающие эффективность трансформаций различных клеточных линий

Вещество, повышающее эффективность трансформации

Донорная ДНК Реципиентные клетки

HSV-1 внк

HSV-tk Мышиные эритролейке-

мические

HSV-tk то же

SV40 Клетки почек обезьяны

HSV-2 Клетки почек кролика

HSV-2 Го же

HSV-2

HSV-2

Повышение эффективности трансфекции по сравнению с контролем

Ссылки

ДМСО

Глицерол

Колхицин Колцемид Цитохалазин D Колхицнн+ колцемид+ цитохалазин D

1 В этом случае использовался липосомный метод (разд. 2,4), а во всех других перечисленных здесь работах — кальций-фосфатный метод (разд. 2.1).

10-100 [П1

20 [21

25 [2]

10—2001 [12]

6 [13]

4 [13]

4 [13]

27 [13]

2.1.8. Котрансформация

Метод котрансформации был разработан для введения и экспрессии в клетках млекопитающих последовательностей ДНК, не кодирующих никаких селектируемых маркеров [14]. Чтобы

100

О 5 Ю 15 20

Концентрация ДМСО,-%

Рис 5 Влияние ДМСО на инфекционность ДНК HSV-1 [11]. Клетки ВНК инфицировали вирусной ДНК (0,04 мкг на чашку) и инкубировали в течение 4 мин в присутствии ДМСО различной концентрации в HEPES-солевом растворе (/) или в среде Игла (//).

24

Глава 1

получить контрансформанты, реципиентные клетки инкубируют с донорной ДНК и одновременно с другой ДНК, кодирующей, какой-либо селектируемый маркер, например содержащий tk-тев! HSV. Трансформацию реципиентных клеток и отбор проводят как обычно. Отбирают ТК+-трансформанты (табл. 1 и 2) и проверяют их на котрансформацию методом гибридизации с гиб-ридизационной пробой или каким-либо другим доступным методом.

Опыты по котрансформации с /?-геном HSV-1 и бактериофагом 0X174, или плазмидой pBR322, или клонированным геном ?-глобина кролика [14] позволили получить линии мышиных клеток, содержащих множественные копии ^трансформирующих генов. Частота котрансформации очень велика: ко-трансформирующую ДНК содержат свыше 90% трансформантов. С помощью такой системы котрансформации можно осуществить введение и стабильную интеграцию практически любого выбранного гена в культивируемые клетки, не прибегая к «сшиванию» данного гена с ДНК какого-либо вектора или с генами, кодирующими биохимически селектируемые маркеры.

2.2. ДЭАЭ-декстрановый метод

ДЭАЭ-декстрановый метод впервые был разработан для исследования инфекционности РНК полиовируса [15] и в дальнейшем был распространен на изучение инфекционности ДНК SV40 [16] и вируса полиомы [17]. Для этих вирусов данный метод до сих пор является наиболее предпочтительным. С помощью ДЭАЭ-декстранового метода была исследована также инфек-ционность других вирусных ДНК (вирусов ВК, AAV-1, аденовируса 5, HSV-1).

Существуют две основные разновидности этого метода [18]. В первом случае вирусную ДНК смешивают с ДЭАЭ-декстра-ном и смесь добавляют к реципиентным клеткам. Во втором варианте реципиентные клетки предварительно обрабатывают растворами ДЭАЭ-декстрана и затем инкубируют с вирусной ДНК. В обоих случаях реципиентные клетки промывают изотоническим солевым раствором до и после инкубации с ДНК или с ДНК + ДЭАЭ-декстраном. Используемая концентрация ДЭАЭ-декстрана варьирует от 100 до 1000 мкг/мл в зависимости от свойств реципиентных клеток и выбранной методики. При стандартных методах трансфекции трансфицируется лишь небольшая часть клеток обезьяны ( — 4%), инкубированных с ДНК SV40. Однако если использовать разработанные недавно новые методики, в которых инкубация клеток обезьяны BSC-1 с ДНК в присутствии низких концентраций ДЭАЭ-декстрана производится более продолжительное время, чем ранее [19], то полу-

Экспрессия экзогенной ДНК в клетках млекопитающих

25

Таблица 7. ДЭАЭ-декстрановый метод эффективного инфицирования клеток обезьяны с помощью ДНК SV40 [19]

1. Посейте 3-105 клеток обезьяны BSC-1, находящихся в логарифмической фазе роста, на чашку Петри (3,5 см в диаметре) с 3 мл среды Игла в модификации Дульбекко (среда DME)1, содержащей сыворотку теленка в концентрации 7%. Проинкубируйте чашку при 37 °С 24 ч в С02-инку-баторе.

2. Когда начнет образовываться монослой, промойте клетки дважды средой DME без сыворотки2.

3. Проинкубируйте клетки с 0,7 мл сверхслиральной ДНК SV40 в концентрации 100 мкг/мл в среде DME, содержащей 50 мМ трис-HCl (рН 7,3), 200 мкг/мл ДЭАЭ-декстрана (мол. масса 2-Ю6) при 37"С в С02-инкуба-торе.

4. Через 8 ч после инфицирования промойте клетки один раз средой DME без сыворотки и проинкубируйте их при 37 °С в среде DME, содержащей сыворотку теленка в концентрации 7%.

5. Затем либо подсчитайте число колоний, либо проверьте клетки на наличие временной экспрессии ?-антигена SV40.

•Стандартный учет бляшек

а. Через сутки после инфицирования трилсинизируйте клетки, разбавьте их и посейте поверх клеток BSC-1, еще не образовавших сплошного монослоя, так, чтобы на каждую чашку Петри было посеяно достаточное число клеток для образования ~50 бляшек.

б. Проинкубируйте чашки при 37 °С в течение 2 ч, чтобы клетки прикрепились.

в. Слейте среду и замените ее средой DME, содержащей 2—5% сыворотки и 0,5% агара Нобля. Проинкубируйте чашки при 37 "С 6—8 сут.

г. Окрасьте клетки, наслоив на содержимое чашек по 3 мл 0,1%-ного нейтрального красного в среде DME, содержащей 0,5% агара Нобля. Бляшки можно будет увидеть и подсчитать на следующий день.

Временная экспрессия ?-антигена SV40

а. Через 8—24 ч после инфекции зафиксируйте клетки в смеси ацетон: метанол (9 : 1 по объему) при —70 °С 10 мин.

б. Проинкубируйте зафиксированные клетки с хомячковой антисывороткой к олухолевуму антигену SV40 в термостате с увлажнением при 37 °С 30 мин.

в. Промойте клетки буфером PBS3 30 мин при 37 "С.

г. Проинкубируйте клетки 30 мин при 37 °С с козьими антителами к IgG хомячка, связанными с флуоресцеином, в присутствии бромистого эти-дия в конечной концентрации 2 мкг/мл.

д. Дважды промойте клетки буфером PBS и один раз дистиллированной водой.

е. Поместите клетки в смесь глицерол : PBS3 (2:1 по объему) и просмотрите их под микроскопом в УФ-свете (ртутная лампа). При экспрессии опухолевого антигена SV40 будет наблюдаться флуоресценция клеток.

1 Фирмы Gibco.

2 Этот этап важен для получения высокой эффективности трансфекции.

3 Состав этого буфера приведен в табл. 3, п. 1.

чаются более обнадеживающие результаты: при инкубации в течение 8 ч в присутствии 200 мкг/мл ДЭАЭ-декстрана воспроизводимо инфицируется 25% клеток. Эта более эффективная методика инфицирования клеток обезьяны BSC-1 с помощью ДНК SV40 описана в табл. 7.

26

Глава 1

Механизм действия ДЭАЭ-декстрана неизвестен. На этот счет было высказано несколько предположений, например, что ДЭАЭ-декстран связывается с ДНК и защищает ее от нуклеаз, или взаимодействует с клеточной мембраной и таким образом перемещает ДНК к клеточной поверхности, подготавливая ее к включению, или стимулирует пиноцитоз. Как бы то ни было, эта методика позволяет трансфицировать до 25% клеток ДНК SV40 [19], в то время как с помощью кальций-фосфатной методики трансфицируется в лучшем случае 15% клеток [20].

2.3. Микроинъекция

2.3.1. Истинная микроинъекция

Для введения рекомбинантных ДНК в клетки млекопитающих были разработаны методы микроинъекции нуклеиновых кислот с помощью стеклянных микропипеток [21—25]. Когда ДНК, несущую ген tk, инъецируют в ьАТК~-клетки мыши, у 50—100% клеток наблюдается временная тимидинкиназная

Таблица 8. Введение ДНК в клетки млекопитающих методом микроинъекции [24]

1. Вырастите реципиентные клетки на маленьких стеклянных покровных стеклах (площадь 1 см2).

2. Приготовьте стеклянные микропипетки из стеклянного капилляра (Omega Dot Tubing, 1,2 мм OD, W. P. Instruments) с помощью приспособления для вытягивания микропипеток (например, Model ? 77 Brown-Flanning apparatus, Sutter Instruments). Диаметр кончиков стеклянных микрошшеток должен быть порядка 0,1—0,5 мкм.

3. Подготовьте приспособление для микроинъекции следующим образом. Расположите микропипетку таким образом, чтобы микроинъекцию можно было проводить под прямым визуальным контролем на предметном столике инвертированного фазово-контрастного микроскопа (например, Leitz Diavert, объектив 400?). Перемещайте микропипетку с помощью микроманипуляторов (например, Narishige МО-15, снабженным гидравлическим микродвижком, перемещающим пипетку вдоль ее оси).

страница 5
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88

Скачать книгу "Транскрипция и трансляция. Методы" (6.57Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(21.03.2019)