Биологический каталог




Транскрипция и трансляция. Методы

Автор Б.Хеймс, С.Хиггинс

>Tet

CAT

Рис. 6. Мечение кодируемых плазмидами белков в мини-клетках. После выделения мини-клетки метили [а55]-метионином (табл. 13 и 14). Образцы анализировали в 15%-ном ПААГ в присутствии ДСН и проводили радиоавтографию в течение 12 ч. 1—DS410; 2 и 3 — DS410, содержащий pACYC184; 4 и 5 —DS410, содержащий pLG517; 6 —DS410, содержащий pBS42. Препараты мини-клеток, использованные для проб 2 и 4, хранились при —70 °С в течение года, а мини-клетки проб 1 и 3 были свежеприготовленными. Белки Tet, CAT, Кап, РВР5 и РВР6 описаны в табл. 2.

3.7. Возможные проблемы

Основная проблема, с которой чаще всего сталкиваются при получении мини-клеток, — загрязнение препарата жизнеспособными клетками. Прежде чем использовать мини-клетки, следует оценить степень загрязнения одним из двух способов. Первый заключается в разведении препарата мини-клеток бактериальным буфером (Лбое—2,0; табл. 13, п. 13) и посеве

Прокариотические системы экспрессии генов in vivo

207

аликвоты на питательный агар. После инкубации при 37 °С в течение ночи подсчитывают число колоний. Мини-клетки не могут расти, так как не содержат нуклеоида. Загрязнение препарата мини-клеток на уровне Ю5 жизнеспособных клеток в 1 мл и меньше можно считать приемлемым. Другой способ проверки загрязнения основан на фазово-констрастной микроскопии (рис. 5). Для этого мини-клетки (Л6оо = 2,0) просматривают под микроскопом перед замораживанием (табл. 13, п. 14) При увеличении 400Xналичие одной родительской клетки в поде зрения соответствует концентрации примерно 105 клетка/мл, что и составляет приемлемый уровень загрязнения [29]. К сожалению, описанные методы достаточно надежны только при значительном уровне загрязнения. Кроме того, приемлемый уровень загрязнения зависит от относительной силы промоторов исследуемых генов, а о нем можно судить лишь после того, как мини-клетки проинкубированы с < [355]-метионином и меченые белки проанализированы с помощью электрофореза в ПААГ—ДСН и последующей радиоавтографии.

Если все-таки загрязнение клетками остается проблемой, можно добавить во время инкубации 100 мкг/мл ампициллина (натриевая соль), чтобы убить жизнеспособные клетки. Если же мини-клетки содержат плазмиду, кодирующую ?-лактамазу, можно вместо ампициллина использовать D-циклосерин (100 мкг/мл).

Было показано, что если штамм Е. coli DS410 несет мутацию гесА, мини-клетки довольно плохо отделяются от целых клеток. Кроме того, клонирование некоторых генов, кодирующих белки оболочки Е. coli, в составе многокопийных плазмид может нарушать деление клеток DS410 и приводить к низкому выходу очищенных мини-клеток. Поэтому при работе с плазмидами, которые надо поддерживать в гесЛ-хозяине, или несущими гены, нарушающие образование мини-клеток, необходимо использовать другую систему экспрессии генов, например макси-клетки (разд. 4).

3.8. Фракционирование мини-клеток

В отличие от обычных бактериальных клеток мини-клетки довольно трудно разделять на мембранные, цитоплазматиче-ские и периплазматические фракции [21, 30]. В частности, количественное выделение мембранных фракций может оказаться невозможным, и тогда для этой цели придется воспользоваться какой-нибудь другой системой экспрессии генов.

3.9. Появление полипептидов-предшественников

Очень часто в мини-клетках обнаруживаются предшественники обычных белков (например, ?-лактамазы; см. работу

208

Глава 6

[30]). Хотя это явление не мешает работе, его следует учитывать. То же самое справедливо и в отношении макси-клеток (разд. 4).

3.10. Заражение мини-клеток бактериофагами

Очищенные мини-клетки можно заразить бактериофагами» и использовать их таким образом в качестве сопряженной системы транскрипции и трансляции генов, кодируемых этими фагами, как в системе хозяйских клеток, облученных УФ-светом (разд. 2). Если речь идет о фаге, экспрессию фаговых белков можно подавить путем заражения мини-клеток, несущих плазмиду, кодирующую ген фагового репрессора. Этот подход был рассмотрен в работе [29].

4. Система макси-клеток

4.1. Введение

У Е. coli имеется несколько систем репарации ДНК, поврежденной УФ-светом и другими мутагенами [31]. Мутации в генах гесА и uvrA приводят к инактивации основных систем репарации, а клетки становятся крайне чувствительны к УФ-облуче-нию. Прямое подавление транскрипции из-за образования пиримидиновых димеров сопровождается интенсивной деградацией хромосомной ДНК внутриклеточными нуклеазами. Поэтому при последующей инкубации в таких макси-клетках синтезируется очень мало белка из-за отсутствия транскрибируемой ДНК Однако если такие штаммы содержат мультикопийную-плазмиду, многие плазмидные молекулы переживут УФ-облуче-ние благодаря своему небольшому размеру по сравнению с хромосомной ДНК- При последующих инкубациях эти плазмидные молекулы служат матрицами для транскрипции, и при добавлении меченых аминокислот происходит избирательное мечение белков, кодируемых плазмидой.

4.2. Выбор штамма бактерий для получения макси-клеток

Для получения макси-клеток часто используют штамм Е. coli CSR603, у которого нарушены все основные механизмы репарации повреждений ДНК, поскольку он несет мутации гесА, uvrA и phr. Поэтому данный штамм крайне чувствителен к УФ-свету: одно-единственное УФ-индуцированное повреждение хромосомы летально для клетки. Клетки легко трансформируются небольшими плазмидами; крупные плазмиды можно

Прокариотические системы экспрессии генов in vivo

20Ф

РВРе

-Tet

САГ.

Рис. 7. Мечение кодируемых плазмидами белков в макси-клетках. Белки макси-клеток метили [355]-метионином (табл. 16). Образцы анализировали с помощью электрофореза в 15%-ном ПААГ в присутствии ДСН и проводили флюорографию в течение 24 ч. 1 — CSR603, 2 —CSR603, содержащий PACYC184; 3 —CSR603, содержащий pLG517; 4 — CSH26rec/ 5 — CSH26recA, содержащий pACYC184; 6 — CSH26recA, содержащий pLG517. Белки Tet, CAT и PBP6 охарактеризованы более подробно в табл. 2.

ввести в них с помощью конъюгации. Однако штамм CSR603 иногда трудно поддерживать, он плохо выживает на чашках; к тому же, по нашим данным, фон включения, обусловленный остаточной транскрипцией хозяйских матриц, заметно варьирует.

В работе [32] сообщалось, что для получения макси-клеток можно использовать штаммы, несущие только мутацию гесА. В частности, авторы исследовали штам CSH26 (АгесА) в качестве альтернативы штамму CSR603. Хотя CSH26 гесА менее чувствителен к УФ-облучению, чем CSR603, фоновую экспрессию хромосомной ДНК можно понизить до уровня экспрессии

14-953

210

Глава 6

? клетках CSR603 в оптимальных условиях (рис. 7). К тому же штамм CSH26 гесА легче поддерживать и выращивать и он надежнее в работе, чем CSR603. Следует подчеркнуть, что для получения макси-клеток ген гесА должен быть инактивирован. Например, штамм recA+ uvrA не подходит. Это объясняется тем, что recA-белок не только участвует в рекомбинационной репарации, но также каким-то образом регулирует активность основной клеточной нуклеазы — экзонуклеазы V. Этот фермент является продуктом генов гесВ и гесС, он отвечает практически за всю деградацию хромосомной ДНК в УФ-облученных клетках.

Во многих экспериментах по клонированию используют трансформацию какого-либо гесЛ-штамма, чтобы свести к минимуму перестройки в клонируемых фрагментах ДНК. Поэтому особенно удобно, если тот же самый штамм можно использовать для получения макси-клеток: это облегчает идентификацию продуктов клонированных генов без переноса плазмиды в другого хозяина для получения макси-клеток.

4.3. Подходящие плазмиды

Система макси-клеток подобно мини-клеткам, более надежна, если используемая плазмида сравнительно невелика и представлена большим числом копий. Санкар и др. ![33] обнаружили, что ColEl-подобные мультикопийные плазмиды, не поврежденные при облучении, продолжают реплицироваться, причем содержание плазмидной ДНК в клетках, в которых 80% хромосомной ДНК деградировано, за 6 ч инкубации возрастает в 10 раз. Эти авторы показали, что можно использовать тетрамер pBR322 (17,4 kb). Наконец, недавно удалось идентифицировать в макси-клетках белки, кодируемые плазмидой длиной 40 kb, представленной всего 1—2 копиями на клетку (N. Mack-man, личное сообщение). Это показывает, что метод макси-клеток позволяет работать с самыми разными плазмидами.

4.4. Получение макси-клеток

Материал и штаммы, необходимые для получения макси-клеток, перечислены в табл. 15. Выделение плазмид и трансформация штамма для получения макси-клеток проводятся так же, как это описано выше для системы мини-клеток (табл. 10 и 11 соответственно). Пропись мечения белков, кодируемых плазмидой, в макси-клетках приведена в табл. 16, но некоторые моменты следует отметить особо.

1. Клетки выращивают до середины экспоненциальной фазы в минимальной среде М9 с добавлением казаминовых кис-

Прокариотические системы экспрессии генов in vivo

211

Таблица 15. Бактериальные штаммы и растворы, необходимые для приготовления системы макси-клеток

Бактериальные штаммы1

Е. coli CSR603; phrl recAl uvrA6 thrl leuB6 argE3 thil aral4 lacYl galK2 xyl5 mtll supE44 tsx33 gyrA96 rpsL31, или ?. coli CSH26 гесА; (recA)k (pro lac)A thi ara rpsL или их производные, содержащие необходимые плазмиды

Растворы

Минимальная среда М92, содержащая 0,2% казаминовых кислот Антибиотики для селекции плазмидных маркеров Минимальная среда М9 Ампициллин (натриевая соль) (3 мг/мл)

10,5%-ная (вес/объем) смесь аминокислот для включения метионина (Difco)

[35s]-MeTHOHHH (10 мкКн/мкл; 1000 Ки/ммоль) L-метионин (8 мг/мл) Бактериальный буфер2

Буфер для нанесения на гель для электрофореза с ДСН2

1 Подробнее о выборе штамма бактерий см. в разд. 4.2.

2 Приготовление растворов описано в табл. 3.

лот. Используют именно эту среду, а не богатую среду типа питательного бульона, так как последняя содержит УФ-погло-щающий материал, который мешает при облучении клеток (табл. 16, п. 3).

2. После облучения (п. 3) клетки инкубируют 1 ч при 37 °С, чтобы поврежденные клетки перестали расти. Все жизнеспособные растущие клетки, которые могли бы вытес

страница 48
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88

Скачать книгу "Транскрипция и трансляция. Методы" (6.57Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(10.12.2019)