Биологический каталог




Транскрипция и трансляция. Методы

Автор Б.Хеймс, С.Хиггинс

лне подходят для последующей трансформации. Приведенная пропись основана на методе Холмса и Квигли [24], ио можно использовать другие методы (см., например, работу [25] или гл 7, табл 8)

2 Составы сред и буферных растворов даны в табл. 3.

3.5. Получение мини-клеток

ем). Их можно готовить обычным образом, с помощью градиентных сосудов. Альтернативный простой метод формирования градиентов — замораживание и оттаивание (табл. 12), Эта процедура позволяет получать вполне пригодные, воспроизводимые сахарозные градиенты и дает возможность в один прием подготовить большое их число. Затем проводят очистку мини-клеток, как это описано в табл. 13. Некоторые из представленных там операций следует обсудить подробнее.

1. Бактерии выращивают на богатой среде до стационарной фазы обычно в течение ночи. Мини-клетки продолжают образовываться в стационарной фазе в течение нескольких часов [21].

2. Первое низкоскоростное центрифугирование (табл. 13, п. 3) позволяет удалить часть нормальных (содержащих ну-клеоид) клеток и предотвращает перегрузку сахарозных градиентов.

3. Получение мини-клеток включает два последовательных центрифугирования в градиенте сахарозы (табл. 13, пп. 5 и 9). На рис. 4, Б показан профиль градиента после первого центрифугирования. Жизнеспособные клетки образуют широкую зону у дна пробирки и частично осаждаются. Зона мини-клеток вил-

202

Глава 6

Таблица 11. Приготовление компетентных клеток и их трансформация1

1. Вырастите ночную культуру нужного штамма бактерий в питательном бульоне при 37 °С.

2. Разведите культуру свежим питательным бульоном в 50 раз и растите до Л6оо = 0,2. Охладите во льду.

3. Перенесите 30 мл культуры в центрифужную пробирку и осадите клетки центрифугированием в течение 10 мин при 3000g при 4 "С (например, в роторе Sorvall SS34 при 5000 об/мин).

4. Отбросьте супернатант и ресуспендируйте осадок в 15 мл 0,1 ? СаСЬ, охлажденного во льду. Оставьте во льду на 20 мин.

5. Осадите клетки, как описано в п. 3; они образуют на дне пробирки мутное кольцо с размытыми краями.

6. Отбросьте супернатант и ресуспендируйте осадок в 1 мл 0,1 ? СаОг, охлажденного во льду. Храните до использования при 4 °С2. Теперь это «компетентные» клетки, т. е. они способны претерпевать трансформацию.

7. Перенесите 0,2 мл компетентных клеток в микроцентрифужную пробирку и добавьте 0,1 мкг плазмидной ДНК. Поставьте также контрольный опыт с компетентными клетками без ДНК. Оставьте обе пробирки во льду на 1 ч.

8. Подвергните клетки тепловому шоку, перенеся их в водяную баню с температурой 42 °С на 5 мин.

9. Разбавьте каждую пробу 2 мл питательного бульона и проинкубируйте на качалке при 37 °С в течение по меньшей мере 1 ч, чтобы признак устойчивости к антибиотику, кодируемый плазмидой, успел экспрессироваться.

10. Посейте по 100 мкл серийных разведений клеток на чашки с питательным агаром, содержащим соответствующие антибиотики, и проинкубируйте в течение ночи при 37 °С.

11. Переколите подходящую колонию. Чтобы обеспечить генетическую гомогенность колонии, рассейте ее хотя бы один раз штрихом до отдельных колоний, прежде чем использовать для дальнейших экспериментов.

1 Составы сред и буферных растворов приведены в табл. 13.

2 Компетентность клеток увеличивается при 4 °С в течение примерно 24 ч [26], а затем их жизнеспособность резко падает. Компетентные клетки можно ресуспендировать в 0,1 ? СаСЬ, 30%-ном глицероле и заморозить при —70 °С [27). Такие замороженные клетки можно хранить в течение нескольких месяцев.

Таблица 12. Приготовление сахарозных градиентов

1. Разлейте пипеткой по 35 мл минимальной среды М91, содержащей 20% (вес/объем) сахарозы, в нужное число пробирок. Используйте прозрачные центрифужные пробирки, чтобы полосы были видны. Лучше всего подходят полисульфоновые пробирки объемом 50 мл.

2. Поместите пробирки в холодильник на —70 °С не менее чем на I ч или до полного замораживания градиентов.

3. Накануне эксперимента поместите пробирки на ночь в холодильник на 4 °С, чтобы их содержимое оттаяло.

1 Составы сред и буферных растворов приведены в табл. 3.

на обычно над нормальными клетками, хотя эти две зоны не всегда хорошо разделяются. Следует отобрать только верхние 2/3 содержимого зоны мини-клеток (табл. 13, п. 7). Это снижает риск загрязнения жизнеспособными клетками. После

Прокариотические системы экспрессии генов in vivo

203

Таблица 13. Получение мини-клеток1

1. Вырастите 400 мл культуры Е. coli DS410 или того же штамма, несущего плазмиду, в питательном бульоне, содержащем соответствующий антибиотик. Продолжайте инкубацию до поздней стационарной фазы роста (раздел 3.5, п. 1).

2. Охладите клетки в течение 10 мин при 4 °С

3. Отцентрифугируйте клетки 5 мин при 700g (например, в роторе Sorvall GS3 при 2000 об/мин) и затем перенесите супернатант в чистые центрифужные стаканы.

4. Соберите мини-клетки и оставшиеся хозяйские клетки центрифугированием в течение 15 мин при HOOOg' при 4 °С (например, в роторе Sorvall GS3 при 8000 об/мин). Отбросьте супернатант.

5. Ресуспендируйте осадок клеток в 6 мл минимальной среды М9 и наслоите суспензию на два сахарозных градиента 10—30% (вес/объем)2.

6. Отцентрифугируйте градиенты в бакет-роторе 18 мин при 4000g при 4 °С (например, в роторе Sorvall НВ4 при 5000 об/мин).

7. Отберите пастеровской пипеткой верхние 2/з содержимого зоны мини-клеток (см. рис. 4, Б) из каждого градиента и объедините.

8. Добавьте равный объем минимальной среды М9 и соберите мини-клетки центрифугированием при 16 000g в течение 10 мин (например, в роторе Sorvall НВ4 при 10 000 об/мин). Отбросьте супернатант.

9. Ресуспендируйте мини-клетки в 3 мл минимальной среды М9 и наслоите их на сахарозный градиент 10—30% (вес/объем).

10. Отцентрифугируйте градиент, как описано в п. 6. Отберите верхние 2/з содержимого зоны мини-клеток (см. рис. 4, В) и перенесите в пробирку во льду.

11. Добавьте равный объем минимальной среды М9 и измерьте окончательный объем. Определите оптическую плотность препарата при 600 нм.

12. Перенесите мини-клетки в центрифужную пробирку и соберите их, как в п. 8.

13. Ресуспендируйте мини-клетки в минимальной среде М9, содержащей 30% (по объему) глицерола, так чтобы Л6оо = 2,0 (~2·1010 мини-клетка/мл).

14. Перенесите суспензию в стерильную микроцентрифужную пробирку и храните при —70 °С. В этих условиях мини-клетки остаются стабильными по меньшей мере год.

1 Составы сред и буферных растворов и подробное описание штаммов бактерий даны в табл. 3 и 9.

2 Приготовление градиентов описано в табл. 12.

фракционирования мини-клеток во втором сахарозном градиенте зона мини-клеток четко отделяется от жизнеспособных клеток (рис. 4, В). И в этом случае следует отбирать только верхние 2/3 зоны мини-клеток (табл. 13, п. 10).

4. Рекомендуется проверить под микроскопом степень загрязнения мини-клеток жизнеспособными клетками (табл. 13, п. 12) (см. рис. 5 и разд. 3.7), прежде чем суспендировать мини-клетки в минимальной среде, содержащей 30%-ный глицерол, для дальнейшего хранения (п. 13). Их можно хранить в таком виде не менее года без всякой потери активности (рис. 6).

Рис. 4. Очистка мини-клеток в сахарозных градиентах (см. табл. 13). А— штамм, не продуцирующий мини-клеток, первый градиент; ? —штамм Е. coOT)S410, первый градиент (табл. 13); В — DS410, второй градиент (табл, 13). Кажущаяся неравномерность полос — артефакт освещения, а не

метода разделения,

Рис. 5. Фазово-контрастная микроскопия мини-клеток. А — исходная культура DS410; Б — очищенные мини-клетки. УвеличениеX1250. Мини-клетка на фото А отмечена стрелкой.

Прокариотические системы экспрессии генов in vivo

205

3.6. Мечение белков, кодируемых плазмидой

Мечение очищенных мини-клеток описано в табл. 14. Леви [28] сообщал, что мини-клетки содержат какие-то весьма стабильные мРНК с периодом полужизни 40—80 мин. Большинство этих мРНК кодируют наружные мембранные белки. Этот •факт нашел подтверждение в работе [29], где было показано, что заметный уровень трансляции стабильных мРНК сохраняется вплоть до 90 мин инкубации. Поэтому рекомендуется перед добавлением [35S]-метионина провести предварительную инкубацию мини-клеток в течение 60—90 мин при 37 °С. Упомянутые авторы полагают, что достаточно инкубации в течение 1 ч.

Таблица 14. Мечение кодируемых плазмидой белков в мини-клетках

1. Полностью разморозьте суспензию мини-клеток2 и перенесите 100 мкл в стерильную микроцентрифужную пробирку. Остальные мини-клетки снова заморозьте.

2. Осадите мини-клетки (3 мин в микроцентрифуге) и отбросьте супернатант. Ресуспендируйте осадок клеток в 200 мкл минимальной среды М9 и добавьте 3 мкл 10,5%-ной (вес/объем) среды для включения метионина фирмы Difco.

3. Проинкубируйте мини-клетки 90 мин при 37 °С.

4. Добавьте 25 мкКи [355]-метионина (10 мкКи/мкл; 1000 Ки/ммоль) и проинкубируйте 60 мин при 37°С.

5. Добавьте 10 мкл раствора немеченого L-метионина (8 мг/мл) и проинкубируйте еще 5 мин.

6. Осадите мини-клетки в микроцентрифуге (3 мин) и отбросьте супернатант.

7. Ресуспендируйте мини-клетки в 50 мкл бактериального буфера и добавьте 50 мкл буфера с ДСН для нанесения на гель для электрофореза. Прогрейте 3 мин в кипящей водяной бане.

8. Нанесите 25 мкл пробы на пластинку ПААГ с ДСН3. Остаток храните при — 20 "С.

9. После электрофореза проведите радиоавтографию или флюорографию геля для выявления меченых белков3.

1 Составы сред и буферных растворов даны в табл. 3.

2 Препараты мини-клеток (приготовленные так, как это описано в табл. i3) можно оттаивать и снова замораживать много раз без заметной потери активности. Клетки можно оттаивать при 37 °С.

3 Описание подходящих методик можно найти в работе [10].

Хотя это и не обязательно, можно ввести в инкубационную среду с [35S]-метионином смесь для введения меченого метионина (фирма Difco). Это повышает эффективность включения изотопа.

Рис. 6 иллюстрирует некоторые примеры синтеза белков, кодируемых плазмидами, в мини-клетках.

206

Глава 6

1 2 3 4 5

страница 47
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88

Скачать книгу "Транскрипция и трансляция. Методы" (6.57Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(10.12.2019)