процедура.

2. Система проще, чем мини-клетки, для проверки большого числа плазмид.

1. Может использоваться для любой клонированной ДНК, в том числе для небольших линейных фрагментов. Это позволяет однозначно соотнести продукты клонированной ДНК со сравнительно небольшими ее участками и отличить их от продуктов, кодируемых вектором.

1. Использование системы, естественно, ограничивается векторами на основе фага ?.

2. Остаточный фоновый синтез хозяйских полипептидов с мол. массой ниже 20 кДа может помешать обнаружению продуктов клонированного гена в этом диапазоне мол. масс

3. Меченые аминокислоты включаются со сравнительно низкой эффективностью, поэтому для обнаружения меченых продуктов необходимы флюорография и длительные экспозиции

1. Большое число копий некоторых генов, клонированных в плазмидах, может нарушить образование мини-клеток и/или помешать их эффективной очистке.

2. Введение дополнительных мутаций (например, гес А) в штамм-продуцент мини-клеток может приводить к тем же последствиям.

3. Мини-клетки трудно фракционировать.

1. Систему довольно трудно отладить.

2. Интерпретация результатов часто затруднена из-за присутствия продуктов абортивной трансляции и/или протеолитического расщепления, особенно ? случае больших белков (>60 кДа).

188 Глава 6

Продолжение Система Достоинства Недостатки

2. Весьма эффективное включение метки позволяет быстро анализировать продукты.

3. Может использоваться для изучения экспрессии генов.

4. Имеет значительные преимущества в тех случаях, когда необходимо идентифицировать продукты неохарак-теризованного гена.

клеток в присутствии ,[35S]-метионина позволяет избирательно пометить белки, кодируемые плазмидой.

3. Система макси-клеток. Клетки УФ-чувствительного штамма Е. coli облучают небольшой дозой УФ-света, и поврежденная ДНК быстро деградирует во время последующей инкубации. Благодаря небольшому размеру мишени по сравнению с бактериальной хромосомой часть плазмидных молекул уцелеет при такой обработке. Поэтому введение [355]-метионина в сре-

Таблица 2. Характеристики некоторых плазмид1

Раз- Чи(сло копий

Плазмида (на один Гены Продукты генов и их

мер, kb бактериаль- мол. масса

ный геном)

pACYC184 4,0

pLG517 10,4

pBS42 12,2

Устойчивость к хлор-амфениколу (CmR)

Устойчивость к тетрациклину (TcR)

dacC

Тс"

dacA

Устойчивость к кана-мицину (KmR)

Хлорамфеникол-ацетилтрансфераза (CAT); 25 кДа Белок, определяющий устойчивость к тетрациклину; 34 кДа Пенициллинсвязыва-ющий белок 6 (РВР6); 40 кДа Белок, определяющий устойчивость к тетрациклину; 34 кДа Пенициллинсвязыва-ющий белок 5 (РВР5); 42 кДа Канамицинфосфо-трансфераза I (Кап); 27 кДа

Карты плазмид приведены на рис. 1.

Прокариотические системы экспрессии генов in vivo

189

Таблица 3. Состав сред и буферных растворов

Агар Луриа (L-агар)1

1%-ный триптон (фирмы Oxoid)

0,5%-ный дрожжевой экстракт (Oxoid)

0,5%-ный NaCl

1,5%-ный агар (Oxoid № 3)

Доведите ? ? до 7,4 Минимальная среда М9 [6]

40 мМ Na2HP04

20 мМ КН2Р04 8 мМ NaCl

20 мМ NH4C1 1 мМ СаС12

10 мМ MgS04

Проавтоклавируйте растворы СаС12 и MgS04 отдельно от других компонентов и смешайте, когда они остынут. Храните при комнатной температуре.

Питательный бульон

Приготовьте 2,5%-ный водный раствор сухой питательной среды (Oxoid № 2). Проавтоклавируйте его при 1 атм 15 мин и храните при комнатной температуре.

Питательный агар

Добавьте в питательный бульон агар (Oxoid № 3) до концентрации 1,5%. «Триптиказный» агар2

1%-ный «триптиказный» пептон

0,5%-ный NaCl

1,5%-ный агар (Oxoid № 3) Бактериальный буфер

50 мМ Na2HP04

20 мМ КН2Р04

70 мМ NaCl

0,4 мМ MgS04

Проавтоклавируйте и храните при комнатной температуре. Лямбда-буфер

10 мМ MgS04

0,05%-ная (вес/объем) желатина 6 мМ трис-HCl, рН 7,2

Проавтоклавируйте и храните при комнатной температуре. Буфер для нанесения на гель для электрофореза с ДСН

0,125 ? трис-HCl, рН 6,8

20%-ный глицерол

2%-ный ДСН

5%-ный 2-меркаптоэтанол

0,001%-ный (вес/объем) бромфеноловый синий

Храните при комнатной температуре. Буфер СТЭТ

8%-ная (вес/объем) сахароза

5%|-ный тритон Х-100

50 мМ ЭДТА

50 мМ трис-HCl, рН 8,0

Проавтоклавируйте и храните при 4°С.

1 Мягкий агар Луриа содержит 0,7% агара.

2 Мягкий «триптиказный» агар содержит 0,7% агара.

190

Глава 6

?+

?

dacC

ApdacC ? =^"^M™t '

? ?

Рис. 2. Карты бактериофагов, рассмотренных в настоящей главе в качестве примеров. А. Бактериофаг ?+; указаны промоторы Рь и Pr и направление транскрипции с них во время инфекции. В лизогенных штаммах эти промоторы подавлены продуктом гена cl, который транскрибируется вместе с телом rex (его функция неизвестна) с промотора Рм. Более подробно биологические свойства фага ? описаны в работе [3]. Б. Бактериофаг XpdacC—вектор для клонирования на основе фага ?, содержащий fcoRI-фрагмент dacC, кодирующий пенициллинсвязывающий белок 6 Е. coli (РВР6).

ду при последующей инкубации позволяет избирательно пометить белки, кодируемые плазмидой. Эту систему обычно называют макси-клетками в отличие от описанных выше мини-клеток.

Каждая из трех систем имеет свои преимущества и недостатки. Выбор той или иной системы экспрессии генов in vivo зависит прежде всего от вектора, использованного для клонирования, и от самого клонированного гена. Сравнительная оценка этих систем приведена в табл. 1. Кроме того, в таблицу включены для сравнения характеристики системы экспрессии in vitro, разработанной Зьюби и описанной в гл. 7. Свойства плазмид, рассмотренных в качестве примеров в настоящей главе, приведены в табл. 2 и на рис. 1, а карты бактериофагов — на рис. 2. Состав общих для всех трех систем сред и буферных растворов указан в табл. 3.

2. Система клеток-хозяев, облученных УФ-светом

2.1. Введение

В системе клеток-хозяев, облученных УФ-светом, транскрипция бактериальной хромосомы подавляется большой дозой УФ-облучения [1, 2]. При последующем заражении фагом ? лишь <фаговая ДНК может служить матрицей для транскрипции. Добавление [35S]-метионина позволяет специфически пометить кодируемые фагом белки. Биология фага ? и его использование :в качестве вектора для клонирования рассмотрены в сравнительно недавно опубликованном обзоре [3].

Прокариотические системы экспрессии генов in vivo

191'

Рис. 3. Анализ кодируемых фагом белков, синтезированных в УФ-облучен-ных клетках. Фагоспецифичные белки были помечены, как описано в табл 8 Образцы анализировали в 15%-ном ПААГ в присутствии ДСН и флюорогра-фировали. Дорожки /, 2 и 3 (хозяйский штамм Е. coli \ЬШпа) экспонировали 3 сут, а дорожку 4 (хозяйский штамм Е. coli 159) —2 ч. / — контроль-2 — ?+; 3 — XpdacC; 4 — ?+. Дорожка 4 демонстрирует спектр белков, кодируемых фагом ? и синтезируемых в нелизогенном хозяине; в то же время' в лизогенном по фагу хозяине синтезируются только два основных белка — продукты генов тех и cl, расположенных в области иммунности фага ? Из электрофореграммы 3 видно, что синтезируется дополнительный белок РВР6, кодируемый XpdacC (см. табл. 2).

192

Глава 6

Если бактериальный штамм, используемый для облучения, лизогенен по фагу ?, то клетки будут содержать белок-репрес-сор (продукт гена cl). Он свяжется с любой суперинфицирующей фаговой ДНК и полностью подавит транскрипцию с основных промоторов PL и Pr. В этих условиях должна транскрибироваться только область иммунности, кодирующая продукты генов cl и rex и имеющая собственный промотор ([3]; см. также рис. 3). Будут транскрибироваться также любые бактериальные гены, клонированные вместе со своими промоторами в составе суперинфицирующего фага. Это позволит избирательно пометить продукты клонированных генов. Очевидно, этот подход не годится для генов, клонированных в фаговом векторе без бактериальных промоторов или если бактериальные гены имеют очень слабые промоторы, поскольку в этом случае их экспрессия зависит от транскрипции с сильных фаговых промоторов PL или Pr.

Хотя в настоящей главе мы обсудим только заражение Е. coli фагом ?, подобные системы использовались для идентификации белков, кодируемых специализированными трансдуци-рующими фагами Р22 Salmonella typhimurium [4] и 029 Bacillus subtilis [5].

2.2. Материалы и штаммы

Материалы и штаммы, используемые для системы клеток-хозяев, облученных УФ-светом, перечислены в табл. 4.

Таблица 4. Штаммы и растворы, необходимые для приготовления системы УФ-облученных хозяйских клеток

Штаммы бактерий1

Е. coli 159 uvrA

или ?. coli 159 uvrA (? ind) Бактериофаги

Например, ?+ (титр 1010 БОЕ/мл) Растворы

Среда М9 с мальтозой (раствор мальтозы автоклавируют отдельно и добавляют в минимальную среду М92 в качестве источника углерода) Среда М9 с мальтозой, содержащая 20 мМ MgCb Лямбда-буфер2

[35Sj-метионин (10 мкКи/мкл; 1000 Ки/ммоль; Amersham International) L-метионин (8 мг/мл) Бактериальный буфер2

Буфер для нанесения на гель для электрофореза с ДСН2

1 Подробнее о выборе штамма бактерий-хозяев см. в разд. 2.3. 3 Приготовление описано в табл. 3.

2.3. Штамм бактерий-хозяев

В качестве штамма-хозяина обычно используют Е. coli 159 (uvrA gal rpsL) [1]. Мутация uvrA инактивирует один из важнейших путей репарации ДНК в клетках и делает их осо-

Прокариотические системы экспрессии генов in vivo

193

_Таблица 5. Получение фага1_

1. Вырастите ночную культуру штамма бактерии-хозяина в питательном бульоне, содержащем 10 мМ MgCl2.

2. Подготовьте серийные разведения фага в конечном объеме фагового буфера 100 мкл. Добавьте к каждому разведению 50 мкл культуры бактерий и оставьте на 10 мин при комнатной температуре, чтобы произошла адсорбция фага.

3. Добавьте к каждому разведению 3 мл расплавленного мягкого агара Луриа2, который перед этим стоял при температуре 50 °С. Быстро перемешайте смесь и налейте ее поверх свежеприготовленного агара Луриа1 в чашках.

4. Проинкубируйте чашки при 37 °С в течение ночи. Если фаг несет мутацию cl 857, проинкубируйте чашки вначале 20 мин при 42 °С, а потом в течение ночи при 37