Биологический каталог




Транскрипция и трансляция. Методы

Автор Б.Хеймс, С.Хиггинс

тина (разд. 4.2). Методом гибридизации с кДНК было проведено сравнение меркурированных транскриптов, полученных с использованием в качестве матрицы нативного и реконструированного хроматина печени зародыша мыши [1, 43]. В этих исследованиях показано, что количество глобиновых РНК-транскриптов, синтезированных на реконструированном хроматине, было промежуточным между количеством, ожидаемым при случайном синтезе на ДНК, лишенной белков, и на нативном хроматине. При сравнении препаратов хроматина, реконструированного при различных концентрациях соли и мочевины (разд. 6.2), было обнаружено, что степень точности реконструкции, которую оценивали путем анализа специфических транскриптов, варьирует [1]. Дальнейшее исследование этих матриц методом электронной микроскопии подтвердило, что ни один из проверенных методов реконструкции, если судить по неупорядоченному образованию нуклеосом, не является особенно эффективным [1]. Кроме того, наблюдались протяженные участки ДНК, лишенной белков, а местами большие аморфные скопления ДНК

184

Глава 5

и белка. Эти данные можно объяснить, предположив, что для правильного восстановления структуры нуклеосом нужна определенная временная последовательность специфических гис-тон-гистоновых взаимодействий. Присутствие мочевины во время реконструкции подавляет эти взаимодействия, а удаление ее на конечных этапах реконструкции приводит лишь к общему неспецифическому взаимодействию ДНК с гистонами. В ряде работ по реконструкции нуклеосом in vitro [48, 49], в которых использовали изолированные гистоны, показано, что в этом процессе важную роль играют промежуточные продукты: гис-тоновый тетрамер (НЗ-Н4) и гистоновый димер (Н2А-Н2В). Однако даже при строго контролируемых условиях сборка нуклеосом является неполной [48]. Точная реконструкция хроматина была продемонстрирована in vitro только с экстрактами из ооцитов Xenopus [50] и с геномами SV40, выделенными из клеток, инфицированных SV40 [51].

В целом роль образования нуклеосом как фактора, определяющего специфичность транскрипции, не ясна. Тот факт, что препараты эукариотической РНК-полимеразы II содержат белки, направляющие инициацию путем узнавания промоторных последовательностей ДНК, заставляет предполагать, что для функционирования регуляторных механизмов полной реконструкции хроматина, возможно, не требуется [52].

Литература

1. Gilmour R. S. In: The Cell Nucleus, vol. 6, Busch H. (ed.), Academic Press, New York and London, p. 329, 1978.

2. Axel R., Cedar H., Felsenfeld G. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 70, 2029 (1973).

3. Gilmour R. S., Paul J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 70, 3440 (1973).

4. Steggles A. W., Wilson G. W., Kantor J. ?., Picciano D. L., Falvey ?. Anderson F. W. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 71, 1219 (1974).

5. Barret Т., Maryanka D., Hamlyn P. H., Gould H. J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 71, 5057 (1974).

6. Chiu J. F., Tsai Y. H., Sakuma K-, Hnilica L. S. J. Biol. Chem., 250, 9431 (1975).

7. MacGillivray A. J. In: Subnuclear Components, Birnie Q. D. (ed.), Butter-worths, London, p. 209, 1976.

8. Stein G. S., Stein J. L. In: Methods in Cell Biology, vol. 19, Stein G., Stein J. S. and Kleinsmith L. J. (eds.), Academic Press, Inc., New York and London, p. 379, 1978.

9. Manley J. L, Fire ?., Cano ?., Sharp P. ?., Gefter M. L. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 3855 (1980).

10. Burgess R. R. J. Biol. Chem., 244, 6160 (1969).

11. Hondo H. G., Blatti S. P. Biochemistry (Wash), 16, 2334 (1977).

12. Bautz ?. I. C. R., Dunn J. J. Biochem. Biophys. Res. Commun., 34, 230 (1969).

13. SmithS. S., Brown R. Eur. J. Biochem., 82, 309 (1978).

14. Smith ?. M., Huang R. С. C. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 73, 755 (1976).

Транскрипция хроматина

185

15. Crouse G. F., Fodor E. J., Doty P. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 70, 1564 (1976).

16. Biesmann H., Gjerset R. ?., Levy W. В., McCarthy B. J. Biochemistry (Wash.), 15, 4356 (1976).

17. Beebee T. J. C, Butterworth P. H. W. Eur. J. Biochem., 66, 543 (1964).

18. Towle H. C, Tsai M. J., Tsai S. Y., O'Malley B. W. J. Biol. Chem., 252, 2396 (1976).

19. Zasloff M., Felsenfeld G. Biochem Biophys. Res. Commun., 75, 598 (1977).

20. Zasloff M., Felsenfeld G. Biochemistry (Wash.), 16, 5135 (1977).

21. Giesecke K., Sippel A. E., Nguyen—Ни ?. С, Groner В., Hynes ?. ?., Wurtz Т., Schutz G. Nucleic Acids Res., 4, 3943 (1977).

22. Pays E., Donaldson D., Gilmour R. S. Biochim. Biophys. Acta, 562, 112 (1979).

23. Pays E., Gilmour R. S. Biochim. Biophys. Acta, 653, 356 (1981).

24. Van Brockhoven C, De Wachter R. Nucleic Acids Res., 5, 2133 (1978).

25. Harrison P. R., Birnie G. D., Hell ?., Humphries S., Young B. D., Paul J. J. Mol. Biol., 84, 539 (1974).

26. Young B. D., Harrison P. R., Gilmour R. S., Birnie G. D., Hell ?., Humphries S., Paul J. J. Mol. Biol., 84, 555 (1974).

27. Berk A. J., Sharp P. A. Cell, 12, 421 (1977).

28. Weaver R. F., Weissman C. Nucleic Acids Res., 6, 1175 (1979).

29. Davies R. W. In: Gel Electrophoresis of Nucleic Acids —A Practical Approach, Rickwood D. and Hames B. D. (eds.), IRL Press Ltd., Oxford and Wachington, DC, p. 117, 1982.

30. Maxam A. M., Gilbert W. In: Methods in Enzymology, vol. 65, Grossman L. and Moldave K. (eds.), Academic Press Inc., New York, London, p. 39, 1980.

31. Alan M., Grindlay G.J..Stefani L„ Paul J. Nucleic Acids Res., 10, 5133 (1982).

32. Brown D. К. Т., Pregnell I. В., Paul J. Eur. J. Biochem, 104, 459 (1980).

33. Graziano S. L., Huang R. C. Biochemistry (Wash.), 10, 4470 (1971).

34. Gadski R. ?.. Chae С. B. Biochemistry (Wash.), 15, 3812 (1976).

35. Gilmour R. S., Paul J. In: Chromosomal Proteins and their Role in the Regulation of Gene Expression, Stein G. S. and Kleinsmith L. J. (eds.), Academic

Press Inc., New York and London, p. 19, 1975.

36. MacGillivray A. J., Cameron ?., Krause R., Rickwood D., Paul J. Biochim. Biophys. Acta, 277, 384 (1972).

37. Rickwood D., MacGillivray A. J. Eur. J. Biochem., 51, 593 (1975).

38. Morris ??., Gould H. J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 68, 481 (1971).

39. Chambon P. Eur. J. Biochem, 36, 32 (1973).

40. Noll M., Zimmer S, Engel ?., Dubochett J. Nucleic Acids Res, 8, 21 (1980).

41. Barrett Т.. Maryanka D., Hamlyn P. H., Gould H. J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 71, 5057 (1974).

42. Gilmour R. S. In: Methods in Cell Biology, vol. 19, Stein G, Stein J. S. and Kleinsmith L. J. (eds.), Academic Press Inc., New York, London, p. 373, 1978.

43. Gould H. J., Maryanka D., Fey S. J., Cowling G. J., Allan J. In: Methods in Cell Biology, vol. 19, Stein G, Stein J. S. and Kleinsmith L. J. (eds.), Academic Press Inc., New York and London, p. 387, 1978.

44. Kleiman L., Huang R. C. J. Mol. Biol., 64, 1 (1972).

45. Boseley P. G., Bradbury ?. M., Butler—Browne G. S., Carpenter B. G., Stpe-hens R. M. Eur. J. Biochem, 62, 21 (1976).

46. Richards M., Pardon J. F. Exp. Cell Res. 62, 184 (1970).

47. Axel R., Melchior W., Solner-Webb В., Felsenfeld G. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 71, 4101 (1974).

48. Oudet P., Gross—Bellard ??., Chambon P. Cell, 4, 181 (1975).

49. Ruiz—Carrillo ?., Jorcano J. L, Biochemistry (Wash.), 18, 760 (1979).

50. Laskey R. ?., Mills A. D., Morris N. R. Cell, 10, 237 (1977).

51. Griffith J. Science (Wash.), 187, 1202 (1975).

52. Davison B. L., Egltj J. M., Mulvihill E. R., Chambon P. Nature, 301, 680 (1983).

ГЛАВА 6

ПРОКАРИОТИЧЕСКИЕ СИСТЕМЫ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ

IN VIVO

?. Стоукер, Дж. Пратт, Б. Холланд

1. Введение

В этой главе описаны три основные прокариотические системы экспрессии in vivo: система клеток-хозяев, облученных УФ-светом, «мини-клетки» и «макси-клетки». Все это сопряженные системы транскрипции и трансляции. Они будут обсуждаться в применении к клеткам Escherichia coli и фагу ?. Системы с использованием других видов бактерий или фагов мы рассмотрим лишь в общих чертах.

1. Система клеток-хозяев, облученных УФ-светом. Клетки Е. coli облучают большими дозами УФ-света, чтобы снизить до минимума синтез белка в хозяйских клетках, а затем заражают фагом ?, несущим клонированные гены. В среду для дальнейшей инкубации добавляют [35S]-метионин, чтобы пометить кодируемые фагом белки, и продукты анализируют в ПААГ в присутствии ДСН. Систему можно еще более усовершенствовать, если блокировать синтез большинства белков фага ?. Для этого используют хозяйские клетки, лизогенные по фагу ? или несущие плазмиду, кодирующую репрессор транскрипции фага ? — продукт гена cl.

2. Система мини-клеток. Существует мутантный штамм Е. coli (mink, mm В), который образует большое количество мелких безъядерных клеток (мини-клеток), причем плазмиды, присутствующие в бактериях, попадают в эти клетки. Поскольку в них нет хромосомной ДНК, инкубация очищенных мини-

Рис. 1. Карты плазмид, рассмотренных в настоящей главе в качестве примеров. Жирные черные полоски — участки клонированной ДНК. Сайты расщепления ферментами рестрикции обозначены следующим образом: В — BamHl; ?— ?coRI; ? — Hindlll; S — Sail. Остальные детали приведены

в табл. 2.

Прокариотические системы экспрессии генов in vivo

187

Таблица 1. Достоинства и недостатки прокариотических систем экспрессии генов in vivo и in vitro

Система

Достоинства

Недостатки

Хозяйские клетки, облу-¦ченные

УФ-светом и загаженные фатом ?

/Мини-клетки

.Макси-клетки

Система синтеза белка in vitro, разработанная Зьюби

Фаг ? часто используется на начальных стадиях клонирования генов. Это особенно важно для таких генов, которые, присутствуя в клетке более чем в одной копии, губительны для нее. При этом использование обычного многокопийного плазмидного вектора либо вообще не даст необходимых клонов, либо с высокой вероятностью приведет к клонированию гена с мутацией, снижающей его губительное действие на клетку.

1. Высокая эффективность включения меченых аминокислот.

2. Очищенные мини-клетки можно хранить в течение не менее года.

3. В принципе мини-клетки можно использовать для изучения генов, клонированных в любых плазмидных и фаговых векторах.

1. Простая

страница 43
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88

Скачать книгу "Транскрипция и трансляция. Методы" (6.57Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(14.08.2020)