перенесите гель на лист фильтровальной бумаги Whatman № 3 и высушите его с помощью специального приспособления для сушки гелей (например, фирмы Bio-Rad) 1 ч. В темной фотокомнате положите на высушенный гель лист пленки Kodak Х-ОМАТ или Fuji RX и поместите этот «сэндвич» в кассету для радиоавтографии. Экспонируйте 1—7 дней при — 70 °С.

Размеры защищенного фрагмента ДНК дают полезную информацию относительно сайта инициации in vitro (разд. 5.2.1), но точный сайт инициации определяют методом электрофореза на том же геле набора реакционных смесей Максама и Гилберта [30], полученных с использованием той же меченой ДНК-зонда. Нуклеотидной последовательности сайта инициации транскрипции in vitro соответствует та полоса в «лестнице» последовательностей, которая совпадает по положению с полосой защищенного-фрагмента.

12*

180

Глава 5

1 Альтернативный метод приведен в гл. 2, табл. 6.

2 Важно, что концентрация одноцепочечной ДНК-зонда была избыточной по сравнению с гибридизующейся РНК. Чтобы гарантировать это, рекомендуется провести серию предварительных гибридизаций (табл. 7), в каждой из которых используют разное количество ДНК. Ясно, что в условиях избытка ДНК дальнейшее увеличение количества вносимой ДНК не влияет на количество радиоактивного гибридизовавшегося РНК-транскрипта. При всех гибридизациях суммарное количество присутствующей нуклеиновой кислоты доводят до 50 мкг путем добавления дрожжевой тРНК.

s Формамид деионизуйте способом, описанным в первой сноске к табл. 7.

6. Обоснованность применения РНК-полимеразы Е. coli

Исследования с использованием РНК-полимеразы Е. coli доступных последовательностей ДНК в матрицах были прекращены после того, как Заслоф и Фелсенфелд [19] показали, что многие опыты, в которых этот фермент использовали в присутствии ионов марганца, давали искаженные, артефактные результаты, обусловленные РНК-зависимой транскрипцией этим ферментом (разд 4.1). Как описано выше, использование меркурированных нуклеотидов обеспечивает надежный метод выделения РНК, синтезированной in vitro на хроматине в правильно выбранных ионных условиях синтеза. В этих условиях РНК-полимераза Е. coli и на ядрах, и на хроматине, выделенных из клеток млекопитающих, синтезирует транскрипты, которые очень похожи на продукты, образуемые эндогенной РНК-полимеразой II [23, 32]. По-видимому, инициация РНК-полимеразой Е. coli как на ядерной, так и на хроматиновой матрицах происходит точно на тех же сайтах, что и in vivo.

В силу того что между Е. coli и млекопитающими лежит большая эволюционная пропасть, на самом деле кажется маловероятным, чтобы РНК-полимераза Е. coli узнавала такие же сигналы инициации, как и РНК-полимераза II в клетках млекопитающих. Более того, хотя между Прибноу-боксом в про-кариотической ДНК и ТАТА-боксом в эукариотической ДНК существует большое сходство, расстояния между этими последовательностями и сайтом инициации различны: около 12 bp у прокариот и 25—30 bp у эукариот. Поэтому удивительно, что по крайней мере на ядрах и хроматине клеток К562 РНК-полимераза Е. coli инициирует транскрипцию главным образом в том же основном сайте инициации, что и эндогенная РНК-полимераза П. Вероятно, доступность активного ?-глобинового гена для бактериального фермента определяется конформацией хроматина вокруг сайта инициации. Это подтверждается тем, что РНК, транскрибированная РНК-полимеразой Е. coli на лишенной белков плазмидной ДНК, содержащей последовательности ?-глобинового гена, не дает специфической гибридизации с МЬо ??-?-глобиновой ДНК-зондом (рис. 2,5, дорожка 5).

Транскрипция хроматина

181

Дальнейшее изучение этого явления, возможно, позволит углубить представление о конформации хроматина в промоторных сайтах млекопитающих.

7. Фракционирование и реконструкция хроматина

Для того чтобы понять характер взаимодействий, определяющих известные структурные и биологические свойства хроматина, в течение последних 10 лет предпринимались различные попытки фракционировать хроматин и вновь собирать его in vitro из компонентов.

7.1. Фракционирование хроматина

Описано очень много методов разделения хроматина на отдельные компоненты. Почти во всех случаях для отделения белков хроматина от ДНК используют высокие концентрации соли, часто в присутствии денатурирующих агентов, таких, как мочевина или гуанидинийхлорид. Например, белки хроматина можно выделить путем диссоциации хроматина в 2 ? NaCl, 5 ? мочевине с последующим ультрацентрифугированием для осаждения ДНК [33, 34]. Далее белки можно фракционировать с помощью ряда методов. При этом, однако, из белковой фракции не удаляется РНК. Альтернативная методика, при которой из белков хроматина удаляют и РНК, и ДНК, включает ультрацентрифугирование в 27%-ном (по весу) CsCl и 4 ? мочевине [35].

Хроматин можно также фракционировать, не прибегая к длительному ультрацентрифугированию, а используя хроматографию на гидроксиапатите [36, 37]. Это один из немногих одноступенчатых методов разделения хроматина на составляющие компоненты, описание которого дано в табл. 11. По этому методу ДНК, негистоновые белки (нГБ) и РНК адсорбируются на колонке с гидроксиапатитом в 2 ? NaCl, 5 ? мочевине, тогда как гистоны на ней не задерживаются. При элюции различными концентрациями фосфата натрия ДНК и нГБ выходят по отдельности; при этом происходит также частичное разделение самих белков. Однако в данном методе эндогенная ядерная РНК и масса нГБ не разделяются. Гистоны и нГБ могут быть разделены на Bio-Rex 70 [38].

Альтернативный подход заключается в раздельном выделении различных компонентов хроматина. Так, высокомолекулярную ДНК можно выделить по методу Шамбона [39], гистоны — солевой экстракцией [40], а нГБ можно экстрагировать из хроматина б ? мочевиной, 50 мМ фосфатным буфером пН 7,5 [41, 46]. '

182

Глава 5

Таблица 11. Фракционирование хроматина1

1. Гомогенизируйте хроматин (выделенный согласно табл. 1) в буфере для, хроматина (2 ? NaCl, 5 ? мочевина, 1 мМ фосфат натрия, рН 6,8) с помощью гомогенизатора с тефлоновым пестиком при концентрации ДНК 0,5 мг/мл.

2. Отцентрифугируйте при 15 000g 15 мин и супернатант сохраните.

3. Гомогенизируйте осадок еще раз, как в п. 1.

4. Отберите супернатант и объедините его с супернатантом, полученным после центрифугирования в п. 2.

5. Обработайте супернатанты ультразвуком (2 раза по 15 с), например на ультразвуковом дезинтеграторе MSE при 1,5 А.

6. Отцентрифугируйте при 15 OOOg 15 мин.

7. Нанесите 50—100 мл супернатанта на колонку (16x25 см) с гидроксиапа-титом (Bio-Rad Labs.), уравновешенную буфером для хроматина, самотеком со скоростью протекания 5—10 мл/ч.

8. а) После нанесения промывайте колонку буфером для хроматина до тех

пор, пока не перестанут элюироваться несвязавшиеся гистоны.

б) Затем элюируйте негистоновые белки в двух фракциях, промывая колонку последовательно буфером для хроматина, содержащим 50 мМ натрийфосфат, рН 6,8, и тем же буфером, содержащим 0,2 ? натрий-фосфат, рН 6,82. Вторая фракция негистоновых белков, которая элюируется при более высокой концентрации соли, содержит основную массу хромосомной РНК. Маленькая дополнительная фракция сильно связанных негистоновых белков может быть элюирована буфером для хроматина, содержащим 2 ? гуанидинийхлорид.

в) Наконец, элюируйте ДНК, промывая колонку буфером для хроматина, содержащим 0,5 ? натрийфосфат, рН 6,8.

¦ За основу взят оригинальный метод [361. Из хроматика, содержащего до 10 мг ДНК. материал извлекается практически количественно.

2 Другой вариант — использование градиента концентрации фосфата натрия. ???? этом негистоновые белки элюируются несколько лучше, чем в методе со ступенчатой элюцией.

7.2. Реконструкция хроматина

Различные методы, которые были использованы для избирательной реконструкции хроматина из составляющих компонентов, приведены в ряде обзоров [8, 42, 43]. Основная про-

Таблица 12. Реконструкция хроматина

1. Смешайте высокомолекулярную ДНК (0,5 мг/мл) с хромосомными белками в отношении 1 : 1,5 для гистонов и 1 : 0,5 для негистоновых белков в 2 ? NaCl, 5 ? мочевине, 10 мМ трис-HCl, рН 8,0.

2. Отдиализуйте смесь для реконструкции против 20 объемов этого б\-фера при 4 °С 2 ч.

3. Постепенно снижайте концентрацию солн в смеси последовательным диализом (по 2 ч каждый) против 1 мМ PMSF, 10 мМ трис-HCl, рН 6,8 с 2,0 М, 1,0 М, 0,8 М, 0,6 М, 0,4 ? и 0,2 ? NaCl. Обратите внимание, что мочевина не входит в буферы для диализа.

4. Осадите нерастворимый реконструированный нуклеопротеин центрифугированием при 2000g 10 мин. Промойте его осадок 1 мМ ЭДТА, 10 мМ трис-HCl, рН 8,0.

Транскрипция хроматина

183

пись одна и та же, независимо от тонкостей выбранного метода. Пробы диссоциированного хроматина или разделенных компонентов смешивают в стехиометрических количествах при высокой ионной силе и затем концентрацию соли постепенно понижают до физиологической путем диализа в течение нескольких часов. Эти операции можно проводить в присутствии мочевины, а можно без нее. Стандартная пропись для реконструкции хроматина приводится в табл. 12.

7.3. Точность реконструкции

Благодаря ряду структурных исследований с применением тепловой денатурации [44], кругового дихроизма [45], дифракции рентгеновских лучей [46] и нуклеазного гидролиза [47] было выяснено, что реконструированный хроматин может приобретать некоторые структурные свойства нативного хроматина. Биологическую точность реконструкции можно оценить путем транскрипции in vitro реконструированного хроматина экзогенной РНК-полимеразой Е. coli (разд. 4.2). РНК-транскрипты можно проанализировать методом гибридизации со специфическими кДНК-зондами (разд. 5.1) и методом картирования с нуклеазой S1 (разд. 5.2) и затем сравнить их с транскриптами, полученными на нативном хроматине. Одна из главных погрешностей этого метода заключается в неизбежном повторном включении эндогенной РНК в хроматин в процессе реконструкции. Однако использование меркурированных нуклеотидов позволяет прямо выделять транскрипты, образованные in vitro на матрицах реконструированного хрома