хода транскрипции при каждом наборе условий. Эти данные относятся к транскрипции in vitro глобиновых генов с использованием в качестве матрицы хроматина плода мыши, причем эту транскрипцию сравнивали с транскрипцией глобиновых генов в изолированных интактных ядрах. Условия транскрипции in vitro экзогенной РНК-полимеразой в ядрах идентичны условиям

172

Глава 5

Таблица 8. Определение содержания глобиновых РНК,

Условия транскрипции Результат транскрипции, мкг РНК/мг ДНК Глобиновая РНК в транс-крилтах, нг/мкг РНК Глобиновые РНК-транскрипты в расчете на матрицу, нг глобиновой РНК/мг ДНК

Хроматиновые транскрипты

—полимераза _2 _2 _2

-Ьполимераза 1,5 0,27 0,41

+полимераза +внесенная гло- 1,5 0,36 0,54

биновая мРНК3 + полимераза + актиномицин 0,3 0,31 0,09

D4 Ядерные транскрипты.

—полимераза _2 _2 0,175

+полимераза+а-аманитин6 _2 _2 0,105

-(-полимераза 1,31 1,16 1,52

-(-полимераза+ а-аманитин 1,31 1,07 1,40

+полимераза +внесенная 1,14 1,94 2,21

глобиновая мРНК3 +полимераза + актиноми- 0,30 1,07 0,32

1 Метод выделения ядер приводится в табл. 1, пп. 1—3, а в последующих пунктах той же таблицы описано выделение хроматина (т. е. разрушенных и промытых солевым раствором ядер). Осадки ядер были ресуспендированы в растворе, имеющем состав-5 мМ MgCl2, 25% глицерола, 50 мМ трис-HGl, рН 7,9, 2 мг/мЛ ДНК. По 1 мл нз каждой пробы инкубировали в системе транскрипции in vitro в условиях транскрипции на хроматине, описанных в табл. 5. Меркурированные РНК-транскрипты были очищены методом аффинной хроматографии иа тиолированной сефарозе (табл. 6). Содержание транскриптов глобиновой РНК определяли с помощью меченой радиоактивной глобиновой кДНК-зонда, как это описано в табл. 7. Все цифры выведены из данных по насыщению, полученных в результате отдельных определений.

2 Не измеряли.

3 Добавлена экзогенная глобиновая мРНК (0,5 мкг/мг ДНК-матрицы)

4 Актиномицин D, 250 мкг/мл.

5 В этих случаях в качестве носителя добавляют тРНК Е. coli и выделенную РНК титруют с кДНК Для определения количества эндогенных глобиновых РНК-транскриптов

' Концентрация ?-аманитина 10 мкг/мл.

транскрипции в системе с хроматином (табл. 5). Добавляемая РНК-полимераза быстро проникает в ядра, и поэтому количество образующегося в этом случае РНК-транскрипта сравнимо с количеством, синтезируемым на хроматиновой матрице. На рис. 1 показано, что после инкубации ядер или хроматина в отсутствие РНК-полимеразы Е. coli с глобиновой кДНК гиб-ридизуется только очень небольшое количество РНК. Этот невысокий уровень гибридизации ядерной РНК в данных условиях отражает транскрипцию эндогенной РНК-полимеразой II, которая может быть частично ингибирована добавлением 10 мкг/мл ?-аманитина. Когда инкубацию проводят в присутствии РНК-полимеразы Е. coli, происходит значительное увеличение относительного количества транскрибированной глобино-

Транскрипция хроматина

173

вой РНК, о чем судят ло гибридизации, причем для ядерных матриц эти значения в три раза выше, чем для хроматиновой матрицы. Возросшая транскрипция при использовании ядер почти не меняется в присутствии ?-аманитина; это свидетельствует о том, что значительное увеличение транскрипции глобинового гена связано с экзогенной РНК-полимеразой Е. coli.

В табл. 8 приводится количественная оценка данных, представленных на рис. 1 (см. выше), а также результатов, полученных при проверке эффективности транскрипции глобиновой мРНК- Как и ожидалось, количество глобиновых РНК-транскриптов, образующихся на единицу веса матрицы (ДНК), при использовании ядер втрое выше, чем при использовании хроматина. Вероятно, специфичность транскрипции снижается из-за механической деградации и нарушения структуры хроматина, происходящих при его выделении. С точки зрения матричной специфичности естественно, что она должна быть максимальной в интактном ядре. Важным контролем служит эффект актино-мицина D на транскрипцию in vitro. Как в случае хроматина, так и в случае ядер актиномицин D в концентрации 250 мкг/мл снижает выход суммарной РНК до 20% начальной величины {табл. 8). Однако среди РНК, синтезированных в результате остаточной транскрипции, последовательности глобиновой РНК составляют такую же долю, как и в отсутствие ингибирования {рис. 1, табл. 8, третья колонка). Поэтому можно думать, что эта остаточная транскрипция не является результатом аномального копирования последовательностей эндогенной мРНК, а представляет собой не полностью ингибированный актиноми-цином D обычный зависимый от ДНК синтез. Такая интерпретация подтверждается опытами, в которых доля образующихся глобиновых РНК-транскриптов меняется незначительно при внесении в инкубационные смеси довольно значительных количеств очищенной глобиновой мРНК- Небольшое количество дополнительных глобиновых РНК-«транскриптов» (табл. 8, третья колонка) и незначительная глобинспецифическая транскрипция, сохраняющаяся при ингибировании а-аманитином или актиномицином D (табл. 8), вероятно, представляют собой результат фоновой неспецифической адсорбции эндогенной РНК на тиолированной сефарозе; обычно ее величина составляет 0,05—0,10% эндогенной РНК.

5.2. Картирование сайтов инициации транскрипции с помощью нуклеазы S1

Описанный выше метод анализа с использованием кДНК позволяет количественно оценить генспецифическую транскрипцию. Однако он не несет информации о правильности процесса

174

Глава 5

копирования, т. е. о точной инициации транскрипции в нужных сайтах. Например, последовательности ДНК в хроматине, способные взаимодействовать с РНК-полимеразой, могут транскрибироваться более или менее случайным образом, а не со специфических сайтов инициации, как это происходит in vivo. К счастью, развитие метода картирования с помощью нуклеазы S1 [27, 28] и возможность получения клонированной ДНК, содержащей последовательность определенного гена, позволяют провести анализ сайта или сайтов инициации транскрипции.

5.2.1. Принцип картирования с помощью нуклеазы S1

Теоретически картирование с помощью нуклеазы S1 имеет два возможных варианта. Меченые 32Р-РНК-транскрипты можно гибридизовать с немеченой ДНК-зондом или немеченые РНК-транскрипты можно гибридизовать с меченой 32Р-ДНК-зондом. Первый вариант в определенных ситуациях является предпочтительным; он описан в гл. 3, разд. 3.3. Однако второй вариант дает более высокое разрешение, и мы здесь на нем остановимся.

Для локализации сайта инициации транскрипции этим методом необходим специфический геномный фрагмент рестрикции (ДНК-зонд), обычно охватывающий область, начиная с первого экзона изучаемого гена до некоторой точки, расположенной за предполагаемым сайтом инициации (кэп-сайтом) гена в направлении 5'-конца. Этот фрагмент рестрикции метят по концам 32Р, денатурируют и разделяют его цепи путем электрофореза в геле. Выделяют цепь, комплементарную исследуемой РНК, и ее избыток гибридизуют с немеченым препаратом РНК-транскрипта. РНК, гибридизовавшаяся с меченой ДНК-зондом, защитит от последующего гидролиза нуклеазой S1 часть зонда, лежащую в З'-направлении от сайта инициации транскрипции (под 3'- и ?'-концами автор имеет в виду концы мРНК), но не защитит ту часть, которая находится перед точкой инициации. Точные размеры защищенного фрагмента ДНК определяют методом электрофореза в геле и сравнивают с размерами фрагмента, защищенного аутентичной мРНК- Если транскрипция in vitro была инициирована в правильном сайте, то фрагменты ДНК, защищенные РНК-транскриптами и аутентичной мРНК, будут одинаковыми по размерам. В противном случае размер фрагмента ДНК, защищенного РНК-транскриптами, укажет местоположение действительного сайта инициации in vitro. Важно отдавать себе отчет в том, что информативный ответ можно получить только в том случае, когда 5'-конец ДНК-зонда полностью защищен от деградации нуклеазой S1. Это обычно гарантируется, если 5'-конец ДНК-зонда относится

Транскрипция хроматина

175

к последовательности в первом экзоне, т. е. находится вблизи начала кодирующего участка. Еще одно преимущество такого анализа состоит в том, что при этом сводятся к минимуму эффекты терминации.

5.2.2. Постановка эксперимента

Прописи выделения одноцепочечной ДНК-зонда, меченной 32Р, и использования этого зонда в Sl-нуклеазном картировании приведены соответственно в табл. 9 и 10. Sl-нуклеазное картирование не является непогрешимым диагностическим методом. Если используют слишком мало фермента, то среди истинных гибридов обнаруживают примесь гибридов с дефектом и получают сложный набор фрагментов, с трудом поддающихся идентификации. Чтобы преодолеть эту трудность, используют серии инкубационных проб с разным количеством нуклеазы S1 (табл. 10), начиная от проб, где фермента мало и где наблюдается неполный гидролиз гибридов, до проб с избытком фермента, когда примеси нуклеаз или, возможно, слишком жесткие условия вызывают разрушение даже истинных гибридов. Такое исследование обычно проводят одновременно с РНК, транскрибированной in vitro, и с аутентичной клеточной РНК, чтобы сравнить начальные точки расщепления гибридов.

Таблица 9. Приготовление меченой [32Р]-ДНК-зонда

1. Растворите 0,5—1,0 мкг ДНК-зонда1 в 50 мкл 50 мМ трис-HCl, рН 8,5. Добавьте 1 ед. щелочной фосфатазы из кишечника теленка и проинкубируйте при 37 °С 30 мин для дефосфорилирования ДНК, после чего прогрейте смесь при 60 °С 5 мин, чтобы инактивировать фермент.

2. Проэкстрагируйте пробу равным объемом фенола, насыщенного этим буфером. Проэкстрагируйте водную фазу 200 мкл эфира. К водной фазе добавьте ацетат натрия до конечной концентрации 0,1 ? и затем 3 объема этанола. Оставьте при —20 °С на ночь или при —70 СС на 30 мин, чтобы выпал осадок ДНК.

3. Осадите ДНК центрифугированием (10 00?? 10 мин). Промойте осадок 75%-ным этанолом и лиофилизуйте его.

4. Растворите ДНК в 2,5 мкл 10 мМ трис-HCl, рН 8,0. Добавьте 17,5 мкл 1 мМ спермидина, 0,1 мМ ЭДТА, 20 мМ трис-HCl, рН 9,5. Проинкубируйте при 90 °С 2 мин и затем п