Биологический каталог




Транскрипция и трансляция. Методы

Автор Б.Хеймс, С.Хиггинс

ависимости от используемой плазмиды (например, ампициллин) до конечной концентрации 100 мкг/мл. Проинкубируйте культуру в течение ночи при 37 °С, энергично встряхивая ее.

3. Соберите бактерии центрифугированием при 5000 g в течение 10 мин при 4 °С. Слейте супернатант.

4. Ресуспендируйте осадок клеток в 100 мл охлажденного во льду 50 мМ' трис-HCl, рН 8,0. Отцентрифугируйте бактериальные клетки, следуя л. 3: Такой клеточный осадок можно хранить при —20 °С.

5. Ресуспендируйте клеточный осадок в 50 мл лизисного буфера и поставьте-на 30 мин в ледяную баню.

6. Добавьте 80 мл щелочного раствора (приготовленного согласно п. 1), хорошо перемешайте. Клеточная суспензия должна просветлеть после лизиса клеток. Оставьте во льду на 5 мин.

7. Добавьте 40 мл нейтрализующего раствора. Хорошо перемешайте и оставьте во льду на 15 мин.

8. Отцентрифугируйте при 5000 g в течение 10 мин и профильтруйте супернатант через марлю.

9. Добавьте 100 мл холодного (4°С) изолропанола. Перемешайте и сразу отцентрифугируйте этот раствор при 5000 g в течение 10 мин. Слейте супернатант и высушите осадок (табл. 3, л. 8).

2-953 ________

\~ЫУЧП.. '".Г- :>ИОТЕХА|

fi'8 Глава 1

.10. Растворите осадок в 10,8 мл 1 мМ ЭДТА, 10 мМ трис-HCl, рН 8,0. Добавьте 11,7 г CsCl и прогрейте смесь при 37 °С в течение 10 мин для растворения CsCl. Далее добавьте 1,2 мл раствора бромистого этидия в концентрации 3 мг/мл. Хорошо перемешайте и отцентрифугируйте раствор в двух пробирках по 10 мл в подходящем роторе при 140 000 g 40 ч при 15°С.

.11. После центрифугирования вы увидите в УФ-свете (305 нм) зоны, где сконцентрировалась ДНК. Отберите материал нижней зоны, проколов шприцем стенку пробирки. Это и будет кольцевая замкнутая плазмидная ДНК.

.12. Удалите из препарата ДНК бромистый этидий, проведя три экстракции равными объемами изопропанола. После каждой экстракции доводите объем раствора ДНК до исходного дистиллированной водой.

.13. Отдиализуйте раствор ДНК против буфера следующего состава: 1 мМ ЭДТА, .10 мМ трис-HCl, рН ?,0, для того, чтобы избавиться от CsCl.

1 Этот метод (согласно работе /[5]) дозволяет получить не менее 1 мг рекомбинант-ных плазмид на 500 мл бактериальной культуры. Альтернативный метод описан в гл. 7, табл. 8, а метод выделения плазмид из малого количества культуры — в гл. 6, табл. 10.

1. Если донорной ДНК является геномная ДНК, выделенная непосредственно из эукариотических клеток, то важно, чтобы она была высокомолекулярной, поскольку для большинства генов эукариот характерно наличие интронов, и поэтому длина одного гена может составлять до 60 kb. Метод выделения высокомолекулярной хромосомной ДНК описан в табл. 3.

2. Если донором должна служить рекомбинантная плазмид-:ная ДНК, то наилучший способ ее выделения из бактерий — метод щелочной экстракции с последующей очисткой в градиенте CsCl (табл. 4). При этом ДНК получается достаточно ¦чистой и для эффективной трансформации не требуется ее дальнейшей обработки.

3. Применяя кальций-фосфатный метод, можно использовать фаг ? как таковой без предварительного выделения фаговой ДНК. В принципе этот метод очень эффективен. Рекомбинант-ные фаги, содержащие гены эукариот, использовались в экспериментах по биохимической трансформации (см. разд. 3.1 и работу [6]), например в экспериментах по переносу гена tk, содержащегося в вирусе HSV-1.

Чаще всего для переноса генов в качестве донора используются последовательности ДНК, клонированные в рекомби-нантных плазмидах; именно на их примере мы и рассмотрим методы, описанные в этой главе.

2.1.2. ДНК-носитель

В качестве ДНК-носителя в экспериментах по трансформации клеток можно использовать ДНК тимуса теленка или ДНК •спермы лосося, имеющиеся в продаже. Предварительно они должны быть очищены методом, описанным в табл. 5. Кроме

Экспрессия экзогенной ДНК в клетках млекопитающих

19

Таблица 5. Дополнительная очистка коммерческих препаратов ДНК

1. Приготовьте раствор ДНК в концентрации 1,0 мг/мл в 10 мМ трис-HCl, 1 мМ ЭДТА, рН 8,0.

2. Добавьте 5 ? NaCl до конечной концентрации 0,2 ? и затем сверху наслоите 2,5 объема охлажденного во льду этанола. Намотайте ДНК на стеклянную палочку, медленно вращая ее и перемещая по границе раздела фаз.

3. Промойте ДНК охлажденным во льду 70%-ным этанолом, покручивая в нем стеклянную палочку с намотанной на нее ДНК, 1 мин. Высушите ДНК (табл. 3, п. 8).

4. Растворяйте ДНК в 1 мМ трис-HCl, 0,1 мМ ЭДТА, рН 8,0, в течение ночи.

того, ДНК-носитель можно выделить из эукариотических клеток с помощью метода, представленного в табл. 3 или описанного в работе [7]. Использование эукариотической ДНК-носителя, полученной в лаборатории, обычно позволяет повысить эффективность в 2—3 раза по сравнению с таковой для ДНК, имеющейся в продаже. Геномную ДНК прокариот не рекомендуется использовать в качестве носителя, поскольку она может ингибировать трансформацию клеток млекопитающих [8].

Если при использовании данной ДНК-носителя получается грубый осадок ДНК — фосфат кальция (разд. 2.1) и в результате эффективность переноса генов падает, необходимо уменьшить молекулярную массу ДНК-носителя механическим путем (например, пропустить препарат ДНК пять раз через иглу для инъекций № 19). Следует помнить, однако, что если средняя мол. масса ДНК-носителя становится меньше 10 kb, наблюдается значительное снижение эффективности поглощения клетками клонированной ДНК и ее экспрессии.

2.1.3. Реципиентные клетки

Клетки разных линий заметно различаются по эффективности поглощения экзогенной ДНК и ее экспрессии. Наилучшие результаты получены на L-клетках мыши (LA-клетки), фибро-бластах мыши NIH3T3 и фибробластах почек детеныша хомячка (ВНК). Для культур других клеток, в особенности для первичных культур, наблюдается в 10 и даже в 100 раз более низкая эффективность (рис. 4; разд. 2.1.6).

Наилучшие результаты в опытах по трансформации всегда получают на реципиентных клетках, находящихся в экспоненциальной фазе роста. Поэтому клетки в этой фазе трипсинизи-руют и пересевают при соответствующей плотности на свежую среду за 24 ч до добавления донорной ДНК. Менять среду непосредственно перед добавлением ДНК нет необходимости. Работая с клетками LATK~ и ВНКТК-, мы онаружили, что оптимальные плотности посева для них составляют соответственно 1-10е и 5-Ю5 клеток на флакон (с площадью роста 25 см2).

2*

.20

¦Глава I

2.1.4. Абсорбция копреципитата ДНК— фосфат кальция

Вначале в опытах по трансформации использовали доволь--но небольшие времена абсорбции — 0,5—4 ч [1, 9]. Однако детальный анализ показал, что наиболее высокая эффективность трансформации достигается при более длительной (до 24 ч) .инкубации реципиентных клеток с суспензией [10]. На рис. 2 приведены данные по экспрессии tk-геяа HSV-1 в клеточных линиях LATK- и ВНКТК- при различных временах абсорбции. .Донорной ДНК служила рекомбинантная плазмида рТК1 (рис. 1), несущая tk-тен HSV-1 в плазмиде рАТ153.

2.1.5. Время предселективной экспрессии

О результатах опытов по переносу генов во многих случаях •судят по изменению фенотипа клеток. Часто для этого бывает необходимо использовать селективную среду на специфический биохимический маркер (разд. 3). Полагают, что во многих случаях селекции должен предшествовать некий период экспрессии в неселективных условиях (предселгктивная экспрессия, табл.1, п. 8). На рис. 3 приведена зависимость уровня трансформации, индуцированной ?&-геном HSV-1, клеток с фенотипом LATK-

<

80

.60

40

20 ? ? I

"0 4 8 12 24 48 72 96

Время инкубации, ч

Рис. 2. Влияние продолжительности инкубации реципиентных клеток с донорной ДНК на эффективность трансформации. Мышиные клетки LATK" (/) или клетки сирийского хомячка ВНКТК- (//), растущие во флаконах (с площадью роста 25 см2), инкубировали с донорной ДНК pTKl (40 нг) и носителем—ДНК спермы лосося (10 мкг). Плазмида pTKl является рекомби-»нантом, содержащим ВатШ-фрагмент ДНК HSV-1 (3,5 kb), в который по .Sa/iiHI-сайту плазмиды рАТ153 встроен ген tk (см. работу [2] и рис. 1). Вре-•мя предселективной экспрессии составляло 24 ч (рис. 3). Каждая точка отвечает среднему числу резистентных к HAT колоний, приходящихся на один -флакон, тю данным для пяти флаконов.

Экспрессия экзогенной ДНК в клетках млекопитающих

21

о 100

80

40

<

I

о 5

20

/ /

I 1 1 ? 1

0 6 12 24 Время 48 72 предселективной экспрессии, ч 96 1

Рис. 3. Влияние времени предселективной экспрессии на уровень трансформации. Клетки LATK- (/) или ВНКТК- {II) инкубировали с pTKl (40 нг) и носителем — ДНК спермы лосося (10 мкг) в течение 24 и 12 ч соответственно. Каждая точка отвечает среднему числу резистентных к HAT колоний, приходящихся на один флакон, по данным для пяти флаконов.

в клетки LATK+ от времени предселективной экспрессии. Частота трансформации максимальна при временах предселективной экспрессии 24—48 ч для клеток LATK"" и 12—24 ч для клеток ВНКТК-. Через 48 ч эффективность трансформации снижается, возможно, из-за деградации донорной ДНК. Подобные тесты необходимо проводить, чтобы определить оптимальные условия для данных селектируемых маркеров и данных реципиентных клеток.

2.1.6. Кривые «доза — ответ»

Уровень генной экспрессии зависит от количества донорной ДНК, используемой для трансфекции клеток млекопитающих. Например, в экспериментах по получению стабильно трансформированных клеток, где используются биохимически селектируемые маркеры типа tk-тена HSV, число колоний трансформированных клеток увеличивается с дозой гена. На рис. 4 показана типичная кривая «доза — ответ» для гена tk при времени абсорбции 24 ч и времени предселективной экспрессии 24 ч. Кривые «доза — ответ» неодинаковы для разных генов и меняются в зависимости от таких факторов, как эффективность сигналов регуляции транскрипции данного гена. Из рис. 4 видно также, что реципиентные клетки различаются по своей способност

страница 4
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88

Скачать книгу "Транскрипция и трансляция. Методы" (6.57Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(24.08.2019)