Биологический каталог




Транскрипция и трансляция. Методы

Автор Б.Хеймс, С.Хиггинс

ок. Ресуспендируйте его в 300 мл буфера 3, гомогенизируя вручную.

10. Отцентрифугируйте смесь при 10 OOOg- 10 мин.

11. Слейте супернатант. Растворите осадок в таком количестве буфера 1, чтобы проводимость раствора стала ниже проводимости буфера 1, содержащего 0,13 ? КС1.

И*

164

Глава 5

12. Нанесите пробу (300—400 мл) на колонку с ДЭАЭ-целлюлозой (ДЕ-52, 5x15 см), уравновешенной буфером 1 (табл. 2). Пробу наносите самотеком в течение ~3 ч.

13. Промывайте колонку буфером 1, содержащим 0,13 ? КС1, до тех пор, пока j426o элюата не станет меньше 0,1.

14. Элюируйте линейным градиентом соли, используя 300 мл буфера 1, содержащего 0,13 ? КС1, и 300 мл буфера 1, содержащего 0,4 ? КС1. Соберите фракции по 10 мл.

15. Проверьте каждую вторую фракцию на РНК-полимеразу, используя описанную выше методику. При элюции солевым градиентом этот фермент обычно элюируется в первых нескольких фракциях.

16. Соберите фракции, содержащие РНК-полимеразную активность, и осадите фермент добавлением 35 г сухого сульфата аммония на 100 мл раствора. Перемешивайте во льду 30 мин.

17. Отцентрифугируйте смесь при lOOOOg 10 мин. Слейте супернатант и растворите осадок фермента в 5 мл буфера 1, содержащего 1 ? КО.

18. Нанесите раствор на колонку (3x75 см) с биогелем А 1.5, уравновешенную буфером 1, содержащим 1 ? КО (табл. 2). Проведите элюцию с колонки этим буфером при скорости протока 0,5 мл/мин и соберите фракции по 10 мл. Проверьте РНК-полимеразную активность каждой второй фракции, этот фермент обычно элюируется в первых нескольких фракциях, содержащих белок.

19. Объедините фракции, содержащие РНК-полимеразу, и осадите фермент добавлением 1,5 объема насыщенного сульфата аммония, растворенного) в буфере 4. Перемешивайте во льду 30 мин.

20. Отцентрифугируйте смесь при lOOOOg 10 мин. Слейте супернатант и растворите осадок фермента в буфере 4. Проведите диализ против этого буфера в течение ночи при 4°С.

21. Нанесите раствор фермента на колонку (2x10 см) с ДНК-целлюлозой (табл. 2, 3,5 мг ДНК/мл целлюлозы в колонке), уравновешенной буфером 4. Элюируйте колонку буфером 4 до тех пор, пока А2ео элюата не станет меньше 0,05.

22. Элюируйте РНК-полимеразу буфером 4 с 0,65 ? КО. Осадите фермент добавлением 1,5 объема насыщенного сульфата аммония — так же, как в п. 19.

23. Отцентрифугируйте смесь при lOOOOg" 10 мин. Растворите осадок в 2 мл буфера для хранения (табл. 2) и храните при —20 °С.

1 Стеклянные шарики (диаметром —0,1 мм) предварительно промойте концентрированной НС1 15 мин, а затем дистиллированной водой до нейтрального рН.

скрипции какого-либо активного гена экзогенной РНК-полимеразой II. Более того, эффективность транскрипции препаратами РНК-полимеразы II даже клонированных ДНК-матриц очень низка (копируется только одна молекула ДНК из тысячи), так что обнаружение специфических транскриптов на хроматиновых матрицах — задача нелегкая. По этим причинам первые эксперименты проводили с бактериальными РНК-полимеразами, которые легче выделяются и гораздо более активны в транскрипции. В этой главе описано использование бактериальной РНК-полимеразы для транскрипции хроматина in vitro и обсуждается правомерность использования прокариотического фермента на эукариотической матрице (разд. 6). Транскрипция хрома-

Транскрипция хроматина

165

тина эндогенной РНК-полимеразой обсуждается в гл. 4, разд. 2.5.

Большая часть работ по транскрипции in vitro изолированного хроматина была выполнена с использованием РНК-полимеразы Escherichia coli. Очистка этого фермента подробно описана в литературе. Для нее, как правило, применяют метод Барджеса [10], в котором классическое разделение с сульфатом аммония объединено с последующей ионообменной хроматографией и гель-фильтрацией. Более быстрая очистка включает фракционирование с помощью осаждения полиэтиленимином [11] или связывание на колонках либо с ДНК-целлюлозой [12], либо с гепарин-сефарозой [13]. В табл. 2 и 3 описан метод, который мы предпочитаем другим. Все эти методы приводят к получению конечного продукта с удельной активностью — 800 ед./мг белка (1 ед. фермента осуществляет включение 1 нмоля UTP в РНК за 10 мин при 37°С). В продаже имеется РНК-полимераза Е. coli фирм Sigma Chemical Со. и Miles Research Products.

4. Оптимальные условия транскрипции in vitro

4.1. Проблемы, связанные с эндогенной РНК

В первых экспериментах по исследованию РНК, синтезированных на матрицах хроматина, ограничивались лишь характеристикой популяций РНК по их гибридизационной специфичности. В дальнейшем, когда появились кДНК-зонды, и еще позже, с развитием Sl-нуклеазного картирования, стало возможным выявление специфических мРНК, присутствующих в очень малых количествах. К сожалению, количество эндогенной РНК, инициированной in vivo и связанной с изолированным хроматином, в целом сравнимо с количеством РНК, которое должно синтезироваться in vitro при добавлении РНК-полимеразы. Количество эндогенной РНК в пробе РНК, синтезированной in vitro, можно определить по гибридизации со специфической ДНК-зондом. Чтобы получить количество специфической РНК, транскрибированной экзогенной РНК-полимеразой, количество эндогенной РНК вычитают из общего количества РНК, имеющегося после транскрипции in vitro. Однако в большинстве случаев этот способ неудовлетворителен, поскольку реакции гибридизации зависят от РНК, и таким образом, малейшие различия в количестве примесных эндогенных РНК в сравниваемых пробах могут приводить к результатам, вводящим в заблуждение. По этой причине ранее полученные данные относительно селективной генной экспрессии на изолированном хроматине [2—6] следует считать спорными.

166

Глава 5

Альтернативным способом решения этой проблемы является разделение эндогенной и новообразованной РНК после транскрипции in vitro. Это можно сделать с помощью меркуриро-ванного UTP (Hg-UTP), который включается в РНК бактериальной РНК-полимеразой на матрице хроматина. Транскрипты, образующиеся in vitro, отделяют от эндогенной РНК методом аффинной хроматографии на тиолированной сефарозе; при этом эндогенная РНК, не содержащая замещенных оснований, не связывается с сорбентом, в то время как большая часть мер-курированного РНК-транскрипта хорошо связывается с ним. Связавшийся РНК-транскрипт элюируют с колонки буфером, содержащим тиольное соединение. Очищенный РНК-транскрипт анализируют затем методом гибридизации с кДНК-зондом, специфичным к изучаемому гену. Этот подход был использован несколькими группами исследователей для анализа образованных in vitro транскриптов в системе с хроматином, выделенным из клеток разного типа [14—18]. В последние годы в его адрес был высказан ряд серьезных замечаний [19—21]. В частности, было показано, что при определенных экспериментальных условиях РНК-полимераза Е. coli наряду с ДНК транскрибирует эндогенную РНК. При этом образуются молекулы двухцепочечной гибридной РНК, состоящие из цепи эндогенной РНК и цепи меркурированной антисэнс-РНК; эти молекулы задерживаются на тиолированной сефарозе. К счастью, в отличие от транскрипции ДНК копирование РНК РНК-полимеразой Е. coli не чувствительно к актиномицину D. Поэтому уровень транскрипции, зависящей от РНК, можно определить с помощью простого теста с актиномицином D. Если перед аффинной хроматографией нагреть пробы для денатурации двухцепочечной РНК, то удается отделить эндогенную РНК как от меркурированной, антисэнс-цепи РНК, так и от аутентичных транскриптов, скопированных с ДНК- При использовании в последующем анализе кДНК-зонда, комплементарной только к смысловой цепи РНК, антисэнс-цепь не будет мешать, поскольку она имеет ту же последовательность, что и сама кДНК-зонд. Поэтому гибридизация будет происходить только между кДНК и РНК, транскрибированной на ДНК-матрице.

Несмотря на то что, пользуясь описанным выше методом, можно отличать аутентичную транскрипцию от ложной, очевидно, имеет смысл оптимизировать условия транскрипции изолированного хроматина in vitro таким образом, чтобы происходила только ДНК-зависимая транскрипция. Изучая эту проблему, мы проверили транскрипцию РНК-полимеразой Е. coli ?-глобиновых генов в системе с хроматином печени плода мыши. В результате этой работы были определены условия, при

Транскрипция хроматина

167

которых идет только ДНК-зависимая транскрипция [22, 23]. Ключевую роль в этой системе играют дивалентные катионы. В присутствии ионов Mg2+ транскрипция ?-глобиновых генов является ДНК-зависимой и асимметричной. Это следует из того, что: 1) высокие концентрации актиномицина D (250 мкг/мл) ингибируют транскрипцию на 95%, 2) меркурированные транскрипты гибридизуются с глобиновой кДНК и эти гибриды задерживаются на тиолированной сефарозе и 3) при гибридизации с глобиновой антисэнс-кДНК (т. е. ДНК, комплементарной глобиновой кДНК и имеющей такой же «смысл», как глобино-вая мРНК) не обнаружено сколько-нибудь значительных количеств ?-глобиновой антисэнс-РНК- Напротив, при замене Mg2+ на Мп2+ имеет место заметная РНК-зависимая транскрипция. При этим условиях синтез РНК только на 40—50% чувствителен к антиномицину D, и гибридизация с глобиновой антисэнс-кДНК подтверждает, что копируется эндогенная глобиновая мРНК. Кроме того, есть данные, что молекулы новообразованной двухцепочечной гибридной РНК могут служить матрицами для дальнейшего синтеза (меркурированных) глобиновых РНК-транскриптов, имеющих такую же полярность, как исходная мРНК '[23]. При тепловой денатурации перед хроматографией на тиолированной сефарозе этот фон не устраняется.

4.2. ДНК-зависимая транскрипция хроматина

В этом разделе подробно описаны методы транскрипции хроматина in vitro РНК-полимеразой ?. coli и выделение РНК-транскриптов с помощью аффинной хроматографии на тиоли-

Таблица 4. Выделение меркурированного UTP1

1. Растворите 24 мг UTP в 2 мл 0,1 ? ацетата натрия, рН 6,0, и проинкубируйте раствор при 50 °С 1 ч с равным объемом 0,1 ? ацетата двухвалентной ртути, растворенного в том же буфере.

2. Добавьте 1 мл (в расчете на плотно осевшую смолу) хелатирующей смолы Dowex (50—100 меш., Sigma), предварите

страница 38
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88

Скачать книгу "Транскрипция и трансляция. Методы" (6.57Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(10.12.2019)