., 254, 9339 (1979).

41. Reeve A. E., Johnson L. P. J. Chromatogr., 177, 127 (1979).

42. Schibler U., Marcu К. В., Perry R. P. Cell, 15, 1495 (1978).

43. Rave N.. Crkvenjakov R., Boedtker H. Nucleic Acids Res., 11, 3559 (1979). -44. Bailey J. M., Davidson N. Anal. Biochem., 70, 75 (1976).

-45. Sittman D. В., Graves R. ?., Marzluff W, F. Proc. Natl. Acad. Sci USA 80 1849 (1983).

Транскрипция РНК в изолированных ядрах

159

46. Weintraub ?., Larsen ?., Groudine ?. Cell, 24 333 (1981)

47. Hofer ?., Hofer—Warbinek R., Darnell J. Cell, 29, 887 (1982)

48. D'Alessio J. M. In: Gel Electrophoresis of Nucleic Acids —A Practical' Approach, Rickwood D. and Hames B. D. (eds.), IRL Press Ltd Oxford and Washington, DC, p. 173, 1982.

49. Smith ?. M., Reeve A. E., Huang R. С. C. Biochemistry (Wash.), 17, 493 (1918),

50. Cooper D. L., Marzluff W. F. J. Biol. Chem., 253, 8375 (1978)

51. Furuichi Y., Morgan ??., Muthukrishnan S.. Shalkin A. Proc Natl Acad Sci USA, 72, 362 (1975). ' '

52. Blanchard J. ??., Weber /., Jelinek W., Darnell J ? Proc Natl Acad Sci USA, 75, 5344 (1978). '

53. Yang Y. W., Lerner M. R., Steitz J. ?., Flint S. J. Proc Natl Acad Sci USA, 78, 1371 (1981).

54. Stoute J., Marzluff W. F. Biochem. Biophys. Res. Commun., 107, 1278' (1982).

ГЛАВА 5

ТРАНСКРИПЦИЯ ХРОМАТИНА

С. Гилмор

1. Введение

Изолированный эукариотический хроматин может служить матрицей для транскрипции in vitro, если в инкубационную смесь добавить РНК-полимеразы. Таким образом, в распоряжении исследователей имеется еще одна бесклеточная система для изучения механизмов регуляции генной экспрессии. Более того, поскольку хроматин можно реконструировать из его основных структурных компонентов, такая система позволяет проверять вклад в ее работу каждого из этих компонентов, а также механизм их взаимодействия. Подробный обзор работ, лежащих в основе этого метода, опубликован ранее [1].

С появлением кДНК-зондов для индивидуальных генов стал возможным анализ хроматиновых транскриптов на присутствие в них специфических последовательностей мРНК, содержащихся в очень малых количествах. Применяя такие зонды, несколько групп исследователей получили данные о синтезе тка-неспецифической мРНК на изолированном хроматине при добавлении экзогенной РНК-полимеразы ?[2—6]. Однако интерпретация данных, полученных в этих и дальнейших работах, встретила ряд возражений, касающихся также вообще всех систем транскрипции in vitro. В этой главе сделан обзор методик, связанных с транскрипцией изолированного хроматина. Особое внимание в ней уделяется возможным артефактам, которые следует учитывать при планировании экспериментов.

2. Выделение хроматина

В настоящее время нет единой, оптимальной для всех типов тканей методики выделения хроматина; с этой целью применяют разнообразные приемы. При выборе такого приема следует принимать во внимание следующие моменты:

1. Желательно, чтобы изолированные ядра исходно содержали как можно меньше цитоплазматического материала. Эффективный способ избавления от него состоит в снятии внешней ядерной мембраны неионным детергентом, например тритоном Х-100.

"2. Растворимые компоненты нуклеоплазмы необходимо удалить путем лизиса и экстракции ядер в буферах с низкой ионной

Транскрипция хроматина

161

Таблица 1. Выделение хроматина1

1. Вручную гомогенизируйте 1 г (сырой вес) ткани в гомогенизаторе Даун-са (с зазором 0,025 мм) в 36 мл 5 мМ MgCl2, 1 мМ ДТТ, 3 мМ СаС12, 0,1 %-ного тритона Х-100, 2 мМ трис-HCl, рН 7,5, в течение 2 мин. Оставьте гомогенат во льду на 5 мин.

2. Добавьте 4 мл 2 ? сахарозы и гомогенизируйте еще 30 с.

3. Наслоите 20 мл гомогената на 15 мл 2 ? сахарозы, 1 мМ ДТТ, 5 мМ MgCb, 0,28 ? NaCl, 2 мМ трис-HCl, рН 7,5, и затем отцентрифугируйте в бакет-роторе при 30 000g 1 ч при 4°С. При этом ядра осаждаются.

4. Ресуспендируйте осадок в 20 мл 2 мМ ЭДТА, 1 %-ного тритона Х-100, 0,28 ? NaCl, 1 мМ трис-HCl, рН 7,9, и отцентрифугируйте суспензию в бакет-роторе при 12 000g 10 мин при 4 °С.

5. Промойте осадок три раза в 2 мМ ЭДТА, 1 мМ трис-HCl, рН 7,9, ресус-пендируя и центрифугируя его, как в п. 4. Промытый осадок (вязкий гель) представляет собой хроматин.

1 Если исследуемая ткань богата эндогенными протеазами, то можно добавить бисульфит натрия ('50 мМ) или диизопропилфторфосфат (1 мМ), или PMSF (1 мМ).

силой. Однако при этих условиях не должны удаляться белки, связанные с самим хроматином.

3. Не рекомендуется подвергать хроматин механической деградации и обработке ультразвуком. Такие воздействия делают хроматин более удобным в работе, но при этом могут появляться свободные концы ДНК, а хроматин может разворачиваться из-за удаления белков, в результате чего не исключено изменение транскрипционных свойств хроматина.

4. Некоторые ткани богаты протеазами и нуклеазами. Поэтому необходимо принять меры для снижения деградации хроматина: выполнять все этапы выделения при 4°С и, где возможно, использовать ингибиторы. В опубликованных обзорах [7, 8] дается сравнительная оценка различных препаративных методов, применяемых на самых разных клетках. Метод, описанный в табл. 1 (где учитываются высказанные выше соображения), применим для большинства тканей, с которыми работали в нашей лаборатории.

3. Источник РНК-полимеразы

Эукариотические мРНК синтезируются in vivo РНК-полимеразой П. Недавно описан метод получения фермента из клеток HeLa [9], который способен инициировать синтез РНК с аутентичного кэп-сайта различных выделенных клонированных ДНК-матриц. К сожалению, использование этого фермента в экспериментах на изолированном хроматине или на ядерных матрицах осложнено тем, что невозможно различить истинную de novo инициацию цепей РНК и реактивацию комплексов, ранее неактивных. Это препятствует однозначному пониманию тран-

11—953

162

Глава 5

Таблица 2. Реактивы, необходимые для выделения РНК-полимеразы Е. coli

Буфер 1 (10-кратный)

0,1 ? MgCl2

1 мМ ЭДТА

0,1 ? трис-HCl, рН 7,9 Буфер 2

10 мМ MgCl2

0,01 мМ ЭДТА

0,2 ? КС1

0,1 мМ ДТТ

5% -ный глицерол

50 мМ трис-HCl, рН 7,5 Буфер 3

10 мМ MgCl2

0,1 мМ ЭДТА

1 мМ ДТТ

5%-ный глицерол

25,6 г сульфата аммония (enzyme grade) на 100 мл 10 мМ трис-HCl, рН 7,9

Буфер 4

1 мМ ЭДТА

0,2 мМ ДТТ

10%-ный глицерол

20 мМ трис-HCl, рН 7,9 Буфер для хранения

10 мМ MgCl2

0,1 мМ ЭДТА

0,1 мМ ДТТ

0,1 ? КС1

60%-ный глицерол

10 мМ трис-HCl, рН 7,9 DE-52-целлюлоза

Промойте 200 г целлюлозы Whatman DE-52 (предварительно набухшей) в 0,5 л 2 ? NaCl в течение 30 мин. Слейте супернатант и промойте целлюлозу дистиллированной водой. Внесите целлюлозу в колонку (5X15 см) и уравновесьте ее сначала 10-кратным буфером 1, а затем однократным буфером 1. Биогель А 1,5

Внесите биогель А 1.5 в колонку (3x75 см) и уравновесьте его буфером 1,

содержащим 1 ? КС1.

ДНК-целлюлоза

1. Промойте 50 г целлюлозы Whatman CF-11 абсолютным этанолом (500 мл), дистиллированной водой (500 мл), 1 ? NaOH (500 мл), дистиллированной водой (500 мл) и, наконец, 1 ? НС1 (500 мл). Промойте еще раз дистиллированной водой до нейтрального рН и высушите целлюлозу на воздухе.

2. Растворите 0,8 г ДНК тимуса теленка (Worthington) в 400 мл 1 мМ ЭДТА, 10 мМ трис-HCl, рН 7,5, хорошо перемешайте с сухой целлюлозой CF-Пи затем просушите смесь в токе теплого воздуха или оставьте при 60 °С на ночь.

3. Стеклянной палочкой размельчите комки ДНК-целлюлозы и ресуспендируйте порошок в 400 мл абсолютного этанола.

4. В течение 3 ч встряхивайте ДНК-целлюлозу, одновременно облучая смесь УФ-светом (Gallenkamp, LH530) с расстояния 10 см.

Транскрипция хроматина

163

5. Отфильтруйте ДНК-целлюлозу и промойте ее 3 раза раствором 1 мМ ЭДТА, 10 мМ трис-HCl, рН 7,5 (по 2 л каждый раз).

6. Внесите суспензию ДНК-целлюлозы1 в колонку (2X10 см) и уравновесьте ее буфером 4.

1 Чтобы оценить количество связавшейся ДНК, прогрейте суспензию ДНК-целлюлозы при 100 °С 10 мин. Осадите целлюлозу центрифугированием и измерьте Д2бо супернатанта (1 ед. поглощения при 260 нм соответствует 50 мкг/мл ДНК).

Таблица 3. Выделение РНК-полимеразы Е, coli

Определение активности РНК-полимеразы Е. coli

Описанный ниже метод удобен для проверки степени чистоты РНК-полимеразы Е. coli.

1. Смешайте:

25,0 мкл 50 мМ MgCl2, 0,75 ? КС1, 0,2 ? трис-HCl, ? ? 7,9 3,0 мкл 0,1 ? натрийфосфатного буфера, рН 7,5 12,5 мкл 1 мМ ДТТ 12,5 мкл 1 мМ ЭДТА

по 5,0 мкл 4 мМ растворов каждого из трифосфатов АТР, СТР, GTP

и [3H]-UTP (2,5 мкКи/ммоль)

30 мкл ДНК тимуса теленка (0,7 мг/мл)

12,5 мкл БСА (0,6 мг/мл)

27,5 мкл пробы (если нужно, добавьте воды)

2. Проинкубируйте при 37 °С 10 мин. 100 мкл инкубационной смеси нанесите пипеткой на полоску фильтровальной бумаги Whatman № 3 (1,0x2,0 см) и опустите полоску в охлажденную льдом 10%-ную ТХУ.

3. Промойте ее два раза в 10%-ной ТХУ и один раз в абсолютном этаноле.

4. Высушите полоску, поместите ее в сцинтиллятор и определите радиоактивность на сцинтилляционном счетчике.

Очистка

1. Разрушьте 200 г клеток Е. coli (штамм MRE 600) в 200 мл буфера 2 с 500 г стеклянных шариков1 на встряхивателе Vibromix, включая прибор 5 раз на 2 мин. Во время лизиса поддерживайте температуру ниже 15 "С.

2. Добавьте к лизату 1,5 мл ДНКазы (1 мг/мл) и оставьте его во льду на 30 мин.

3. Слейте жидкость и держите ее во льду. Промойте стеклянные шарики два раза буфером 2 и объедините буфер после промывки с первоначальным супернатантом. Объем буфера для промывки подберите так, чтобы общий объем был 350 мл.

4. Отцентрифугируйте объединенный лизат при 150 OOOg- 3 ч (например, в угловом роторе MSE 65 при 45 000 об/мин).

5. Отберите супернатант и медленно добавьте 23,1 г сухого сульфата аммония на 100 мл, перемешивая раствор во льду. Продолжайте перемешивать во льду еще 30 мин.

6. Отцентрифугируйте смесь при 10 000^ 10 мин.

7. Отберите супернатант и отбросьте осадок. На 100 мл супернатанта, находящегося во льду, добавьте 10,75 г сульфата аммония с перемешиванием.

8. Отцентрифугируйте смесь при 10 000°· 10 мин.

9. Слейте супернатант и соберите осад