низкого содержания ртути ограничивает использование этого носителя фракционированием относительно малых количеств серусодержащих РНК.. Никакой зависимости связывания РНК с Hg-целлюлозой от размеров РНК не обнаружено; достаточно большая a-S-PHK, имеющая коэффициент седиментации 45 S, снимается с этого носителя с выходом —75%.

5.2. Количественная оценка специфических РНК-транскриптов

Количество синтезированной РНК данного типа можно определить методом гибридизации РНК — ДНК- Используемая ДНК-зонд является или двухцепочечной ДНК, клонированной

Транскрипция РНК в изолированных ядрах

139

Таблица 14. Количественная оценка РНК по гибридизации с иммобилизованной ДНК

1. Если необходимо (разд. 5.2), переведите ДНК-зонд в линейную форму, обработав ее соответствующей рестриктазой.

2. Экстрагируйте ДНК фенолом, насыщенным 50 мМ трис-HCl, рН 8,0.

3. Добавьте 2,5 объема абсолютного этанола и осадите ДНК при —70 °С (1 ч) или при — 20 °С (16 ч).

4. Осадите ДНК центрифугированием (lOOOOg, 10 мин, 4°С) и промойте осадок охлажденным во льду 70%-ным этанолом.

5. Высушите осадок ДНК под вакуумом.

6. Растворите ДНК в 0,2 ? ??4??, 2,0 ? NaCl до конечной концентрации 50 мкг/мл.

7. Денатурируйте ДНК кипячением в течение 2 мин с последующим быстрым охлаждением во льду.

8. Нанесите ДНК на нитроцеллюлозный фильтр (Schleicher and Schueli, ВА85), предварительно замоченный в растворе 2XSSC1. Это удобнее всего делать, воспользовавшись аппаратом Hybridot (BRL Inc.). С его помощью можно наносить на дот до 100 мкл ДНК (5 мкг). Удобный способ анализа нескольких проб РНК (по нескольким ДНК-зондам) состоит в приготовлении одного ряда дотов с каждым образцом. Затем фильтр можно разрезать на полоски, каждая из которых будет содержать один дот на один ДНК-зонд.

9. Промойте связавшуюся ДНК 50 мкл раствора 2XSSC, пропуская его через каждую лунку Hybridot.

10. Прогрейте фильтры при 80 СС 2 ч в вакуумном шкафу и затем разрежьте на полоски, готовые к гибридизации.

11. Для уменьшения фоновой радиоактивности, часто связывающейся с фильтром, перед гибридизацией препараты радиоактивной РНК следует очистить от невключившихся меченых нуклеотидов с помощью хроматографии на сефадексе G50 согласно табл. 6, пп. 10 и 11.

12. Объедините фракции, соответствующие свободному объему колонки, добавьте 2,5 объема холодного этанола и оставьте пробу при —70 °С (1 ч) или при —20 °С (16 ч) для выпадения РНК в осадок.

13. Отцентрифугируйте РНК (lOOOOg, 10 мин, 4°С) и затем высушите осадок под вакуумом.

14. Проведите предгибридизацию фильтра-полоски при 52 °С 30 мин, запечатав ее в маленький полиэтиленовый пакет (пользуйтесь специальным электрическим прибором для заклеивания пакетов) в 0,5 мл дегазированного буфера для предгибридизации, приготовленного смешиванием:

0,25 мл деионизованного формамида2

0,125 мл раствора 20xSSC

5 мкл 10%-ного ДСН

5 мкл 0,1 ? ЭДТА, рН 7,5

5 мкл 1,0 ? трис-HCl, рН 7,5

10 мкл poly(A) (Miles) с концентрацией 0,5 мкг/мл 20 мкл ЮОхраствор Денхардта3 5 мкл денатурированной ДНК Е. coli (1 мг/мл) 75 мкл Н20.

15. После предгибридизации осторожно вскройте пакет и слейте буфер. Растворите РНК (п. 13) в 75 мкл воды и смешайте этот раствор с компонентами, перечисленными в п. 14, исключая воду. Перенесите раствор РНК в пакет и вновь запечатайте его, удалив пузырьки воздуха. Инкубируйте при 52 °С 72 ч.

16 После гибридизации вскройте пакет и положите фильтр в ванночку с 20 мл раствора 5XSSC, 0,1%-ного ДСН, 1 мМ ЭДТА, 10 мМ трис-HCl,

140

Глава 4

рН 7,5. Осторожно покачивайте фильтр 30 мин при 52 °С. Повторите эту промывку четыре раза.

17. Вариант 1

Промойте фильтр 1 раз 20 мл раствора O.lxSSC при комнатной температуре. Если требуются более строгие условия отмывки, проводите ее при более высокой температуре (до 65 °С). Вариант 2

Чтобы свести к минимуму неспецифическое связывание РНК с фильтром, проинкубируйте фильтр с 10 мкг/мл РНКазы А в 0,3 ? NaCl 10 мин при 37 °С. Затем промойте фильтр 20 мл 0,3 ? NaCl при 25 °С.

18. Высушите фильтр на воздухе и затем сделайте радиоавтограф, используя, если необходимо, усиливающий экран из вольфрамата кальция.

19. Чтобы оценить количество РНК, связанное с каждым дотом ДНК, нужно:

Вариант 1: просканировать радноавтографическое изображение дота, используя денситометр, предварительно откалнбровав потемнение пленки под действием известного количества этого же радиоизотопа.

Вариант 2: вырезать каждый дот из полоски фильтра и определить радиоактивность на сцинтилляционном счетчике. В этом случае, чтобы вычислить фон, нужно просчитать участок фильтра, по размерам соответствующий доту, но не содержащий связанной ДНК. Можно также определить количество радиоактивной РНК, связавшейся с дотом негомологичной ДНК (например, pBR322).

1 Состав раствора 1XSSC: 0,15 ? NaCl, 15 мМ цитрат (трннатриевая соль).

2 Формамид деионизуйте следующим образом: 100 мл формамида встряхивайте со 100 г смешанной смолы [например, Bio-Rad AG501-X8(D)] 2 ч при комнатной температуре. Отфильтруйте смолу и храните формамид при —20 °С.

3 Состав раствора Денхардта 100-кратной концентрации: 10% безнуклеазиого БСА (например, фирмы BRL), 10% поливииилпирролидона, 10% фикола (мол. масса 400 000). Если гибридизовавшуюся РНК в дальнейшем элюируют с фильтра, то БСА ие добавляют (табл. 15).

в плазмиде, или одноцепочечной ДНК, клонированной в коли-фаге М13. Наиболее удобный метод заключается в иммобилизации ДНК-зонда на нитроцеллюлозном фильтре в виде серии дотов (каждый диаметром —0,5 см). Затем фильтр инкубируют в растворе, содержащем меченые РНК-транскрипты, где происходит гибридизация. После отмывки для удаления негибридизо-вавшейся РНК количество гибридизующейся РНК можно определить или путем радиоавтографии с последующей денсито-метрией фотоизображения, или путем вырезания дотов и подсчета их радиоактивности в жидкостно-сцинтилляционном счетчике. Данная методика описана в табл. 14, однако некоторые моменты требуют дальнейшего обсуждения.

1. ДНК-зонд удобнее всего наносить на нитроцеллюлозный фильтр, пользуясь имеющимся в продаже аппаратом, который позволяет наносить одновременно много проб на один фильтр (обычно 96 проб на лист нитроцеллюлозы с форматом обычной панели для микротитрования 8X12 см). Например, в аппарате Hybridot фирмы BRL Inc (табл. 14), в котором используется фильтрование под вакуумом, ДНК связывается с фильтром по мере прохождения через него пробы. Поскольку сверхспиральная плазмидная ДНК не связывается с нитроцеллюлозой,

Транскрипция РНК в изолированных ядрах

141

CON

lllil-:"'-" «^,-......нз : :til?llllE!:dlpR: '::^?]

Рис. 4. Гибридизация меченой РНК с ДНК-дотами. Ядра выделены из экспоненциально растущих клеток миеломы (CON) или из клеток, обработанных в течение 1 ч 5 мМ гидроксимочевиной (ГМ). Транскрипцию in vitro проводили с меченым радиоактивным предшественником [?-32?]-???. Для каждой гибридизации с дотами различных ДНК-зондов использовали равные количества РНК (4-106 имп/мин). НЗ —ген НЗ мыши, U1 — ген U1 РНК мыши, у. — ген легкой ?-цепи иммуноглобина мыши и pBR — плазмида pBR322. Фильтры промывали и гибридизовавшуюся РНК выявляли с помощью радиоавтографии.

прежде чем использовать эту ДНК. в качестве зонда, ее следует перевести в линейную форму с помощью рестриктазы.

2. Чтобы была гарантия количественного связывания с нитро-целлюлозным фильтром, ДНК-зонд должна иметь размеры минимум 1,0 kb.

3. Перед гибридизацией из препарата РНК нужно удалить методом гель-фильтрации все [32Р]-нуклеотиды. Если этого не сделать, то на радиоавтографах появляется неровный крапчатый фон.

4. В условиях гибридизации, описанных в табл. 14, плазмидную ДНК обычно берут в избытке (за исключением генов структурных РНК, имеющихся в ядре в больших количествах, например рРНК и мяРНК), чтобы гибридизация была количественной. Это проверяют с помощью трех экспериментов:

а) Варьируют количество вносимой РНК; количество гибридизующейся РНК должно быть пропорционально внесенной РНК-

б) Варьируют количество ДНК на фильтре. Это не должно влиять на количество гибридизующейся РНК, если ДНК берут в избытке.

в) Повторно гибридизуют РНК, которая не связалась с фильтром, с той же ДНК; гибридизации не должно быть.

5. В качестве контрольной ДНК для учета неспецифического связывания РНК нужно использовать плазмидную ДНК, не несущую изучаемой последовательности ДНК. Обычно фон

142

Глава 4

составляет 0,0001-—0,001% внесенной радиоактивности. Чтобы снизить его и убрать фрагменты РНК, не обладающие полной комплементарностью к ДНК-зонду, фильтры обрабатывают РНКазой А (10 мкг/мл) или РНКазой Т1 (10ед./мл) в 0,3 ? NaCl 10 мин при 37 °С с последующим промыванием в 0,3 ? NaCl (табл. 14, п. 17), высушивают и радиоавтогра-фируют.

Пример использования дот-гибридизации приведен на рнс. 4.

5.3. Определение размеров специфических РНК-транскриптов

Для определения размеров специфической РНК, синтезированной in vitro, используют два подхода:

1. Гибридизуют РНК со специфической клонированной ДНК> гибриднзовавшуюся РНК элюируют и затем определяют ее размеры или

2. РНК фракционируют по размерам перед гибридизацией. Второй подход, вероятно, более удобен для анализа больших РНК-транскриптов, которые во время гибридизации могут деградировать.

5.3.1. Гибридизация перед определением размеров

Чтобы определить размеры полного РНК-транскрипта, РНК, которая гибридизовалась с клонированной ДНК, иммобилизованной на нитроцеллюлозном фильтре, элюируют и затем анализируют методом электрофореза в полиакриламидном геле (молекулы РНК с размерами менее 500 нуклеотидов) или в агарозном геле (для РНК больших размеров). Этот метод описан в табл. 15, Л.

В одном из вариантов этого метода иммобилизованные гибриды ДНК—РНК обрабатывают РНКазой Т1, которая отщепляет части молекулы РНК, лежащие за пределами последовательностей, представленных в клонированной ДНК. РНКаза Т1 эффективно удаляется промыванием фильтров раствором ДСН перед элюцией РНК (табл. 15, Б). В примере на рнс. 5 интакт-ную N1-PHK морского