ессия перенесенного гена (генов).

9. Стадия селекции. Замените среду на соответствующую селективную среду, в данном случае на среду HAT (среда SF12, содержащая 15%-ную сыворотку, 0,1 мМ гипоксантин, 0,4 мкМ аминоптерин, 16 мкМ тимидин)2-3.

10. Обновляйте селективную среду каждые 2—3 сут в течение 2—3 нед, после чего подсчитайте колонии обычным способом4.

11. Чтобы отобрать индивидуальные колонии, слейте ростовую среду и срежьте верх флакона нагретым скальпелем. Поместите специальный цилиндр для клонирования из нержавеющей стали (диаметром 0,4—0,8 см) сверху каждой колонии и снимите клетки, инкубируя их 2—3 мин при комнатной

14

Глава 1

температуре в 0,1 мл 0,25%-го трипсина в стерильном забуференном растворе (6 г NaCl, 2,96 г трехзамещенного цитрата натрия, 1,79 г трицина, 0,005 г фенолового красного на 700 мл дистиллированной воды). Перенесите снятые клетки стерильной пастеровской пипеткой во флаконы со свежей подогретой ростовой средой (площадь роста 25 см2).

? Этот метод можно использовать для введения любой ДНК в клетки млекопитающих как при исследованиях временной экспрессии, так и для стабильной трансформации (разд. 5).

2 Используемая среда зависит от свойств реципиентных клеток.

¦> альтернативный способ приведен в табл. 2; см. также разд. 2.1, п. 6.

4 Ести подсчет нужно вести постоянно, клетки в некоторых флаконах можно, фиксировать в" метаноле, о'хлажденном во льду, в течение 15 мин, затем окрасить 10%-ныМ красителем Гимза (водный раствор) в течение 15 мнн и сполоснуть водопроводной водоя.

2. Молекулярная масса ДНК-носителя влияет на конечную эффективность включения и экспрессии донорной ДНК (разд. 2.1.2).

3. После инкубации в течение 30 мин при комнатной температуре образуется тонкая взвесь ДНК—фосфат кальция, остающаяся в суспензии. Иногда в случае ДНК с очень высокой молекулярной массой образуется грубый неоднородный осадок, и тогда эффективность трансформации оказывается очень небольшой. Эту трудность можно устранить путем более медленного добавления ДНК—СаС12 к 2XHBS и непрерывного перемешивания раствора (например, путем пропускания пузырьков воздуха через смесь или встряхивания на смесителе). Можно также уменьшить молекулярную массу донорной ДНК, пропустив ее пять раз через иглу для инъекций № 19.

4. Затем суспензию ДНК — фосфат кальция добавляют к культурам клеток, не сливая предварительно культуральную среду. Обычно добавляют 1 мл суспензии ДНК — фосфат кальция к 10 мл культуры. Объем вводимой суспензии должен составлять 1/10 объема среды, чтобы конечная внеклеточная концентрация ионов кальция была на нужном уровне.

5. После введения суспензии ДНК — фосфат кальция культуры инкубируют при 37 °С в течение 24 ч. Затем среду заменяют свежей средой и продолжают инкубацию еще в течение 24 ч при 37 °С. Эту среду снова удаляют и заменяют подходящей селективной средой, которую меняют каждые 2—3 сут в течение 2—3 нед. Используемая селективная среда зависит от поставленных задач, свойств реципиентных клеток и наличия селектируемых маркеров (разд. 3). После подсчета выросших колоний клетки трипсинизируют и колонии отбирают для дальнейшего анализа.

6. Другой метод отбора, отличный от описанного в пп. 9—11 табл. 1, заключается в трипсинизации клеток после стадии 8 с последующим высевом их в соответствующих разведениях при селективных условиях в жидкую или полужидкую среду [4]

Экспрессия экзогенной ДНК в клетках млекопитающих

15

Таблица 2. Метод отбора на метоцеле1

1. Приготовьте среду, содержащую метоцель (метоцельная среда), следующим образом:

а. Добавьте 3 г метоцеля МС 4000 CP (Fluka) к 200 мл дистиллированной воды и проавтоклавируйте. После растворения метоцеля получается прозрачный раствор, который можно хранить при 4°С не менее 6 мес.

б. Непосредственно перед использованием подогрейте среду до 37 °С и добавьте:

22,0 мл 10-кратной среды Хэма SF22

4,0 мл 50-кратной смеси незаменимых аминокислот2

4,0 мл 0,1 ? пирувата натрия2

2,5 мл 0,2 ? глутамина2

5,0 мл 7,5%-го бикарбоната натрия2

в. Затем добавьте 100 мл сыворотки и соответствующие количества веществ, необходимых для отбора. Так, для метоцельной среды, содержащей HAT (0,1 мМ гипоксантин, 0,4 мкМ аминоптерин и 16 мкМ тими-дин), надо добавить:

3,40 мл 10,0 мМ гипоксантина

0,34 мл 0,4 мМ аминоптерина

0,34 мл 16,0 мМ тимидина Конечные концентрации метоцеля и сыворотки равны соответственно 0,9 и 30%.

Обратите вниманаие на то, что состав метоцельной среды на стадии (б) зависит от используемой линии клеток, а компоненты, требуемые на стадии (в), — от селектируемого маркера (разд. 3).

2. Начинайте трансформацию в соответствии с пп. 1—8 табл. 1. После этапа 8 проведите трилсинизацию и посчитайте клетки.

3. Смешайте 0,2 мл клеточной суспензии и 20 мл метоцельной среды в пластиковом универсальном флаконе и рассейте на бактериологические чашки (диаметр 9 см), содержащие метоцельную среду. Плотность посева зависит от ожидаемой частоты трансформации; может быть высеяно до 2-Ю6 клеток на чашку.

4. Проинкубируйте чашки при 37 °С в течение 7—10 сут в зависимости от времени удвоения реципиентных клеток.

5. Подсчитайте колонии, пользуясь инвертированным микроскопом. Если потребуется, отберите индивидуальные колонии пастеровской пипеткой и растите их на подходящей ростовой среде (5 мл на чашку, площадь роста

1 Метоцельный метод можно использовать для отбора по любому биохимическому маркеру в любой клеточной линии, которая способна расти в метоцеле, или для отбора доминантных трансформирующих онкогенов (разд. 3.2).

2 Соответствующие исходные растворы поставляет фирма Flow Laboratories Inc

(например, в среду с метоцелем). Этот метод описан в табл. 2. Преимущество высева в метоцель связано с тем, что, поскольку среду не меняют, вторичных колоний в результате размножения первоначальных трансформантов не появляется. Таким образом, посев в метоцель — более количественный метод. Кроме того, поскольку не требуется повторных смен среды, он и менее трудоемок, и значительно более дешев. Метоцельный метод можно применять для любого селектируемого маркера и любой клеточной линии, растущей в метоцеле (т. е. для клеток, рост

16

Глава 1

которых зависит от подложки), или для отбора доминантных трансформирующих генов (разд. 3.2). В таких случаях нужно подобрать соответствующую ростовую среду (разд. 3.1 и 3.2).

Экспрессия донорной ДНК в реципиентных клетках зависит от нескольких факторов, которые мы сейчас и рассмотрим.

2.1.1. Донорная ДНК

В качестве донора можно использовать ДНК любого происхождения, если в ней присутствуют регуляторные последовательности, необходимые для экспрессии генов в клетках млекопитающих (разд. 3 и 5).

Таблица 3. Выделение высокомолекулярной хромосомной ДНК

1. Приготовьте следующие растворы: Г уанидинийхлоридный буфер

Гуанидинийхлорид 76,40 г Ацетат натрия -ЗН20 0,272 г 3flTA-Na2 1,86 г Дистиллированная вода до 90 мл

Нагрейте смесь до 65 "С, чтобы растворились все компоненты, затем охладите ее до комнатной температуры.

Доведите рН до 7,0 с помощью 5М NaOH. Добавьте 5 мл 2-меркапто-этанола. Доведите объем до 100 мл дистиллированной водой. Конечные концентрации компонентов этого буфера: 8 ? гуанидин-НС1, 20 мМ ацетат натрия, 50 мМ ЭДТА, 0,7 ? 2-меркаптоэтанол. Буфер А

Этот буфер имеет следующий состав: 10 мМ NaCl, 10 мМ ЭДТА, 0,5%-ный ДСН, 10 мМ трис-HCl, рН 8,0; он готовится непосредственно перед употреблением из концентрированных растворов. Забуференный фосфатом солевой раствор (PBS) NaCl 8,0 г КС1 0,2 г

Na2HP04 1,15 г КН2Р04 0.2 г

Дистиллированная вода до 1 л

2. Соберите клетки, подсчитайте их и промойте PBS, проводя центрифугирование.

3. Ресуспендируйте 1—2-Ю8 клеток в 5 мл гуанидинийхлоридного буфера. Перемешайте, несильно встряхивая.

4. Осторожно, вручную, гомогенизируйте клетки 8—10 движениями неплотно притертого пестика в гомогенизаторе Даунса. Если ДНК выделяют из

кусочков ткани, может понадобиться измельчить их с помощью гомогенизатора Omnimixer.

5. Добавьте 0,5 мл 20%-ного ДСН (особо чистого, BDH Chemical Co.), прогрейте при 65 °С 1—3 мин и тщательно, но осторожно перемешайте.

6. Осадите ДНК добавлением равного объема изолропанола. Если соль выпадет в осадок и раствор помутнеет, добавляйте 50%-ный изопроланол в дистиллированной воде до тех пор, пока раствор не станет почти прозрачным.

7. Намотайте ДНК на стеклянную палочку и промойте ее последовательно 70- и 100%-ным этанолом.

8. Высушите ДНК в вакуумном лиофилизаторе в течение 5 мин.

Экспрессия экзогенной ДНК в клетках млекопитающих

17

Э. Растворите ДНК в 5 мл буфера А, содержащем 50 мкг/мл протеиназы К (Boehringer). Проинкубируйте при 37 °С в течение ночи.

10. Трижды экстрагируйте ДНК равным объемом хлороформа, разделяя фазы центрифугированием (10 000 g).

11. К водному раствору ДНК добавьте 5М NaCl до конечной концентрации 0,2М, а затем равный объем изолропанола.

12. Намотайте ДНК на стеклянную палочку, промойте и высушите ее, следуя, пл. 7 и 8. ДНК можно осадить также центрифугированием (10 000 g) к высушить, как указано в п. 8.

13. Растворите ДНК в буфере 0,1 мМ ЭДТА, 1,0 мМ трис-HCl, рН 8,0.

Таблица 4. Выделение рекомбинантной плазмидной ДНК

1. Приготовьте следующие растворы: L-бульон

NaCl 5 г

Триптон (Difco) 5 г

Дрожжевой экстракт (Difco) 2,5 г Дистиллированная вода до конечного объема 500 мл. Простерилизуйте эту среду автоклавированием. Лизисный буфер

1 ? глюкоза 2,5 мл

1 ? трис-HCl, рН 8,0 1,25 мл

0,2 ? ЭДТА, рН 8,0 2,5 мл

Лизоцим (Sigma) 250 мг

Дистиллированная вода до конечного объема 50 мл. Щелочной раствор 5 ? NaOH 3,2 мл

10%-ный ДСН 8,0 мл

Дистиллированная вода до конечного объема 80 мл. Нейтрализующий раствор Растворите 11,8 г ацетата калия в ~30 мл воды и доведите рН до 5,С! добавлением приблизительно 5 мл ледяной уксусной кислоты. Добавьте' дистиллированную воду до конечного объема 40 мл.

2. Посейте бактерии в 500 мл L-бульона во флаконе на 2 л. В среду должен быть внесен соответствующий антибиотик в з