е длительном электрофорезе образуются более-диффузные полосы.

6. Окрасьте гель бромистым этидием, чтобы увидеть эндогенные рРНК ir тРНК. При этом транскрибированная РНК не выявляется, так как ее слишком мало в пробе. Этот прием служит проверкой на присутствие в пробах РНК и на отсутствие ее деградации3. Перед окрашиванием бромистым этидием РНК должна быть освобождена от глиоксаля щелочью. Это делают с помощью следующей процедуры.

Погрузите гель в десятикратный по объему раствор 50 мМ NaOH,. 0,5 мкг/мл бромистого этидия на 20 мнн. Перенесите гель в десятикратный по объему раствор 0,1 ? трис-HCl, рН 7,5, 0,5 мкг/мл бромистого этидия на 40 мин. РНК можно увидеть благодаря ее флуоресценции при УФ-осве-щении (300—320 нм).

7. Высушите гель, пользуясь специальным прибором для сушки геля.

8. Экспонируйте высушенный гель с рентгеновской пленкой для выявления 32Р-транскрибированной РНК.

9. Измерив расстояния, пройденные маркерами, постройте стандартную кривую зависимости пройденного расстояния от логарифма молекулярной массы и определите по ней молекулярные массы РНК-транскриптов.

1 Деионизуйте глиоксаль (Eastman), встряхивая его 3 ч со смолой Amberlite (МВ-1) (25 г/100 мл глиоксаля). Отфильтруйте глиоксаль от смолы и храните его порциями ???,5 мл при —20 °С. Он стабилен по крайней мере 6 мес.

2 Меченый 32Р-РНК-маркер можно приготовить путем транскрипции in viiro ДНК-маг-рицы, содержащей известный промотор, например сильный поздний промотор аденовируса 2. Из такой ДНК с помощью различных эндонуклеаз рестрикции легко выделить фрагменты, с которых считываются прерванные РНК известного размера. После обработки глиоксалем такие маркеры сохраняют стабильность до двух месяцев.

3 Деградацию РНК, происходящую во время электрофореза, можно устранить, проводя электрофорез в присутствии ДСН. Для этого добавьте ДСН в буфер для электрофореза до конечной концентрации 0,1% и проведите предварительный электрофорез, при 150 В в течение 45 мии.

96

Глава 3

kb 4.311

1,43

0,63

0,37

Рис. 1. Анализ продуктов прерванной транскрипции с помощью глиоксалирования и электрофореза в агарозном геле. Сконструированные плазмиды (Jove, Manley, неопубликованные данные), содержащие поздний промотор аденовируса 2 и различные участки поздней транскрипционной единицы, были обработаны рест-риктазой и использованы в качестве матрицы для транскрипции in vitro. ДНК были рестрицированы так, чтобы образовались прерванные транскрипты с размерами 1,8 kb (дорожки 1 и 2),7,0kb (дорожки 3 и 4) и 1,95 kb (дорожки 5 и 6 ). Маркеры молекулярной массы (дорожка М) также получены при транскрипции in vitro.

различные участки длинной (30 kb) единицы поздней транскрипции. Очевидно, в бесклеточном экстракте возможен синтез очень длинных РНК вплоть до 7—8 kb, что является пределом. Хотя известно, что рекомбинантные плазмиды кодируют сигналы процессинга РНК, в бесклеточном экстракте в условиях, описанных в разд. 2.2, это показать не удалось.

Скорость элонгации РНК-полимеразой II в реакционной -смеси составляет ~300 нуклеотидов/мин. Подобная скорость зп vivo в 10 раз выше, что частично может быть связано с бо-

Транскрипцня генов эукариот в бесклеточных экстрактах_ 97

1 2 3

Рис. 2. Чувствительность к ?-аманитину транскрипции с позднего промотора аденовируса 2. РНК была синтезирована в реакционных смесях (по 100 мкл), каждая из которых содержала 400 мкКи [a-32P]-UTP (разд. 2.2). В качестве матрицы использовали фрагмент (Ball-E-pBR322), который представляет собой ??/1-фрагмент ДНК аденовируса серотипа 2, встроенный в плазмиду pBR322; этот участок ДНК содержит поздний промотор аденовируса 2, с которого транскрибируется специфическая РНК из 1750 нуклеотидов (показано стрелкой). После инкубации РНК была выделена, обработана глиоксалем и проанализирована методом электрофореза в геле (на анализ израсходован 1 % РНК; разд. 3.1). Реакционная смесь, проанализированная на дорожке 1, содержала 5 мкл бесклеточного экстракта; на дорожке 2 смесь содержала 30 мкл экстракта плюс сс-аманитин (0,5 мкг/мл); на дорожке 3 смесь содержала 30 мкл экстракта.

лее высокой температурой in vivo (37 °С) по сравнению с условиями реакции in vitro (30°С). Скорость накопления прерванных транскриптов in vitro приблизительно линейна в течение часа [5]. :

РНК-полимераза II предпочтительно инициирует транскрипцию на концах фрагментов ДНК и в местах внутренних одно-цепочечных разрывов [18]. Этот фермент способен также метить концы фрагментов ДНК, присоединяя к ним ?[?-32?]-??? и давая полноразмерные меченые молекулы, устойчивые к расщеплению РНКазой. Каждая из катализируемых им реакций чувствительна к ?-аманитину (0,5 мкг/мл). Вместе с тем в некоторых препаратах экстракта обнаружена активность, отвечающая за концевое мечение и устойчивая к ?-аманитину.

Бесклеточный экстракт содержит много растворимых белков клетки. Хотя большинство из них для нашей цели не имеют значения, некоторые могут оказаться помехой в определенных

7-953

98

Глава 3

опытах. Например, экстракты, как правило, содержат большое количество топоизомераз I и II типов, а также ДНК-лигазу. В связи с этим в реакционной смеси может быстро меняться топология ДНК-матрицы, что мешает, к примеру, исследованиям сверхспиральной ДНК. Экстракт содержит также РНК-полимеразы I и III '[16]. Их вклад в транскрипцию можно оценить по степени ингибирования ?-аманитином. Прерванная транскрипция РНК-полимеразой II полностью ингибируется в присутствии 0,5 мкг/мл ?-аманитина (рис. 2), в то время как транскрипция РНК-полимеразой I устойчива к а-аманитину, а РНК-полимераза II ингибируется только при концентрации а-аманитина 200 мкг/мл. В действительности большинство матричных ДНК не содержит промоторов для этих ферментов, и поэтому их присутствие несущественно для включения нуклеотидов. Однако в некоторых геномных клонах встречаются повторяющиеся элементы, которые содержат промоторы РНК-полимеразы III (см., например, [19]).

3.2. Ограничения

Анализ прерванных транскриптов, описанный в разд. 3.1, представляет собой простой, чувствительный и точный метод определения места начала транскрипции РНК, синтезируемых в бесклеточном экстракте. Однако он имеет определенные ограничения.

1. Бесклеточный экстракт содержит относительно высокие уровни нуклеиновой кислоты. Поскольку в основном это 18S-и 28S-pPHK, невозможно проанализировать более 25—50% РНК, содержащейся в 25 мкл реакционной смеси, так как при нанесении всей смеси на одну дорожку геля стандартного размера в области этих РНК будет сильная перегрузка.

2. Специфические транскрипты, считываемые с очень слабых промоторов, иногда трудно обнаружить из-за неспецифической инициации или терминации или из-за присутствия экзогенных нуклеиновых кислот (в частности, ДНК и рРНК и продуктов их распада), меченных по концам соответствующими ферментами, присутствующими в экстракте. Эти ферменты не чувствительны ни к ?-аманитину, ни к актиномицину D, благодаря чему катализируемый ими синтез можно отличить от синтеза РНК de novo. Использование в качестве метки GTP приводит к минимальному концевому мечению, a UTP — к максимальному, в то время как меченые СТР и АТР дают высокие уровни радиоактивности тРНК, которая метится ферментами, катализирующими обмен нуклеотидов на ее З'-конце (ССА).

3. Используя обычный метод прерванной транскрипции, денатурации глиоксалем и определения размеров путем элект-

Транскрипция генов эукариот в бесклеточных экстрактах

рофореза в агарозном геле, можно картировать сайты инициации РНК-транскриптов с точностью только до 20 нуклеотидов. Чтобы картировать 5'-концы РНК более точно, короткие прерванные транскрипты анализируют в полиакриламидном секвенирующем геле. Структуру 5'-конца РНК, синтезированной в бесклеточном экстракте, можно исследовать методом «отпечатков пальцев» (фингерпринтирования) [2,5], однако этот подход используется нечасто.

3.3. Анализ с помощью гибридизации и расщепления нуклеазой S1

Проблему неспецифического мечения РНК, возникающую иногда при применении основного метода (разд. 3.2; п. 2), можно решить с помощью гибридизации 32Р-РНК-транскрип-тов со специфической нерадиоактивной ДНК-зондом и последующей обработки нуклеазой S1, поскольку РНК, не комплементарная ДНК-зонду, разрушается этой нуклеазой. Первый этап

Таблица 4. Удаление ДНК из препаратов РНК-транскриптов

1. Растворите нуклеиновую кислоту, полученную на стадии 9 табл. 2, в 0,2 ? ацетате аммония и затем осадите ее этанолом, как указано в пп. 6 и 7 табл. 2. Лиофилизуйте препарат.

2. Ресуспендируйте высушенный осадок в 100 мкл 10 мМ трис-HCl, рН 7,5, 0,1 ? NaCl.

3. Добавьте ДНКазу, не содержащую РНКазы (если необходимо, обработанную йодацетатом [20]), до концентрации 50 мкг/мл и MgCl2 до конечной концентрации 10 мМ.

4. Проинкубируйте 5 мин при 37 °С.

5. Добавьте 100 мкл 10 мМ ЭДТА, рН 8,0, 0,2%-ного ДСН.

6. Проэкстрагируйте пробу равным объемом смеси фенол — хлороформ — изоамиловый спирт (20:20: 1) и вновь экстрагируйте водную фазу равным объемом хлороформа, как указано в пп. 4 и 5 табл. 2.

7. Добавьте NaCl до конечной концентрации 0,15 ? и 2 объема этанола. Осадите РНК, инкубируя смесь в спирте с сухим льдом 5 мин (или по крайней мере 2 ч при —20 °С).

8. Отцентрифугируйте РНК в микроцентрифуге 5 мин в холодной комнате (4°С).

9. Ресуспендируйте осадок РНК в 60 мкл 0,2%-ного саркозила, 1 мМ ЭДТА, рН 8,0 и храните при —20 °С.

этого анализа заключается в удалении ДНК из неочищенного препарата РНК, выделенной после транскрипции в бесклеточном экстракте, в противном случае ДНК будет мешать реакции гибридизации. ДНК удаляют методом, описанным в табл. 4. Затем, следуя табл. 5, проводят гибридизацию и расщепление нуклеазой S1. Двухцепочечную ДНК обычно прямо используют в качестве ДНК-зонда без предварительной очистки цепи ДНК, комплементарной изучаемой РНК-

7*

100

Глава 3

Таблица 5. Анализ 32Р-РНК-транскриптов с помощью гибридизации и расщепления нуклеазой S11

1. Для анализа РНК-транскриптов, образующихся в результате одной стандартной реакции тра