слоту добавлением сухого сульфата аммония (0,35 г/мл супернатанта). После того как сульфат аммония растворится, добавьте 1,0 мкл 1 ? NaOH на 1 г сульфата аммония и размешивайте суспензию еще 30 мин.

8. Соберите осадок центрифугированием при 15 000 g 20 мин. Полностью слейте супернатант и ресуспендируйте осадок в растворе 40 мМ трис-HCl, рН 7,9, 0,1 ? КС1, 10 мМ MgCl2, 0,2 мМ ЭДТА, 2 мМ ДТТ, 15%-ного глицерола в объеме, равном 1/20 объема супернатанта после ультрацентрифугирования (п. 7).

9. Отдиализуйте суспензию дважды против буфера для ресуспендирования (50—100 объемов каждый раз) в течение 8—12 ч в общей сложности. Во время диализа объем раствора увеличивается на 30—50%.

10. Отцентрифугируйте отдиализованную суспензию при 10 000 g 10 мин, чтобы удалить нерастворимый материал. Окончательный супернатант разделите на маленькие порции (0,2—0,5 мл), быстро заморозьте их в жидком азоте или в сухом льду и храните при —70 °С. При этой температуре экстракт сохраняет полную активность при хранении минимум в течение года; его можно несколько раз подвергать оттаиванию и быстрому замораживанию без потери активности.

92

Глава 3

ками HeLa, которые легко получить в больших количествах. Экстракты этих клеток содержат относительно мало нуклеаз-ной активности, проявляющейся во время инкубации при 30 °С. Подобные экстракты с транскрипционной активностью выделяли и из других клеточных линий. Как правило, культуры, выращенные в роллерных бутылях, дают активные экстракты. Однако большинство других клеточных линий и тканей дают экстракты с низким уровнем транскрипции или с большим количеством нуклеаз.

Подробности метода выделения экстрактов клеток HeLa приведены в табл. 1. Выход экстракта составляет приблизительно 2 мл из 1 л клеточной суспензии (этого количества экстракта достаточно для 100—400 проб), в нем содержится 15— 30 мг/мл белка и до 2 мг/мл нуклеиновой кислоты (преимущественно рРНК). Экстракты должны быть сконцентрированы до такой степени, чтобы при добавлении в пробы их объем был минимальным, а конечная концентрация соли достаточно низкой (соль в высокой концентрации ингибирует транскрипцию; разд. 4.3.2). Попытки получения еще более концентрированных экстрактов путем растворения осадка в меньшем объеме после преципитации (табл. 1, п. 7) или путем тугого завязывания диализного мешка, чтобы предотвратить увеличение объема раствора во время диализа (табл. 1, п. 9), были не всегда успешными из-за повышенного выпадения в осадок белка во время диализа. Диализ против буфера с более низкими концентрациями солей также приводил к получению менее активных лиза-тов в результате повышения преципитации белка.

2.2. Реакция транскрипции

Аналитические реакции удобно проводить в микроцентрифужных пробирках одноразового использования в конечном объеме 25—50 мкл. В состав стандартной смеси (25 мкл) входят:

7,5— 15,0 мкл бесклеточного экстракта

0,2—1,5 мкг ДНК-матрицы

по 50 мкМ АТР, GTP, СТР и UTP

4 мМ креатинфосфат

5 мкКи [32Р] GTP (~10 мКи/мл водного коммерческого препарата, >200 мКи/ммоль).

Обратите внимание, что все соли, необходимые для транскрипции, вносятся с самим экстрактом. Инкубацию проводят при 30 °С 30—120 мин.

При анализе РНК-транскриптов, инициируемых слабыми промоторами, в качестве меченого радиоактивного нуклеозид-трифосфата рекомендуется использовать GTP, поскольку при

Транскрипция генов эукариот в бесклеточных экстрактах

93

этом сводится к минимуму ложное мечение других нуклеиновых кислот (разд. 3.2, п. 2). Однако в других случаях (например, см. разд. 4.1), возможно, лучшей меткой является радиоактивный UTP. Для равномерного мечения РНК-транскриптов; необходим [а-32Р]-нуклеозидтрифосфат; если же метят только-5'-конец транскрипта, то следует использовать нуклеозидтри-фосфат, меченный в ?-положении. Метка в ?-положении стабильна в бесклеточных экстрактах, тогда как метка в ?- и у-положениях может отщепляться благодаря различным киназ-ным и фосфатазным активностям, имеющимся в экстракте. При этом не исключено значительное обменное мечение других ну-клеозидтрифосфатов, и поэтому данные, полученные с трифос-фатами, меченными в ?- или у-положениях, следует интерпретировать с осторожностью.

2.3. Выделение РНК

После определенного периода инкубации реакцию останавливают и выделяют РНК по методу, описанному в табл. 2. Хотя этот метод довольно трудоемкий, он всегда позволяет получить недеградированную РНК, свободную от примесей белка Раствор РНК, полученный этим методом, как правило, не содержит невключившихся нуклеозидтрифосфатов, поэтому количество 32Р в нуклеиновой кислоте можно определить, просто* измеряя черенковское излучение.

Таблица 2. Выделение РНК после транскрипции

1. Для терминации реакции транскрипции (объем смеси 25—50 мкл) добавьте 250 мкл 7,5 ? мочевины, 0,5%-ного ДСН, 10 мМ ЭДТА и 10 мМ трис-HCl, рН 8,0.

2. Добавьте равный объем (275—300 мкл) смеси фенол — хлороформ—изо-амиловый спирт (20:20:1) и встряхивайте на вортексе 30 с. После центрифугирования в микроцентрифу^е (Эппендорф) в течение 5 мин отберите водную фазу (первая водная фаза) и перенесите ее в чистую микроцентрифужную пробирку на 1,5 мл, а органическую фазу и интерфазу оставьте.

3. Добавьте к органической фазе с интерфазой 150 мкл смеси, имеющей, состав: 7 ? мочевина, 0,35 ? NaCl, 1%-ный ДСН, 10 мМ ЭДТА, 10 мМ трис-HCl, рН 8,0, 25 мкг дрожжевой тРНК. Перемешайте на вортексе и затем отцентрифугируйте 20 с. В интерфазе образуется очень плотный осадок белка, из-за чего нельзя отобрать вторую водную фазу. Поэтому отберите органическую фазу пастеровской пипеткой и вновь проэкстраги-руйте интерфазу вместе со второй водной фазой 200 мкл хлороформа. После кратковременного встряхивания и центрифугирования (20 с) вторую-водную фазу отобрать легко.

4. Объедините первую и вторую водные фазы, объем которых составляет-0,45 мл. Добавьте равный объем смеси фенол — хлороформ — изоамило-вый спирт и перемешайте встряхиванием. Отцентрифугируйте 5 мин на. микроцентрифуге и затем отберите водную фазу, оставляя немного рас^ твора над интерфазой.

'94

Глава 3

5. Проведите экстракцию водной фазы еще два раза, каждый раз равным объемом хлороформа. После первой такой экстракции иногда виден небольшой липкий белковый осадок, который следует отбросить с органической фазой. После второй экстракции интерфаза должна быть совершенно чистой.

6. К водной фазе добавьте 1 мл этанола, перемешайте и затем оставьте смесь в спирте с сухим льдом на 5 мин или при — 20 °С минимум на 2 ч.

7. Отцентрифугируйте пробу 5 мин в микроцентрифуге в холодной комнате и слейте супернатант.

8. Осадок ресуспендируйте в 200 мкл 0,2%-ного ДСН, добавьте 200 мкл 2 ? ацетата аммония и затем осадите нуклеиновую кислоту, как описано в п. 6.

9. Повторите стадию п. 8.

10. Лиофилизуйте осажденную нуклеиновую кислоту, растворите ее в 60 мкл 0,2%-ного саркозила, 1 мМ ЭДТА, рН 8,0 и храните при —20 °С.

3. Анализ продуктов транскрипции РНК-полимеразой II

3.1. Эксперименты с прерванной транскрипцией

РНК-полимераза II не терминирует транскрипцию in vitro. Однако в экспериментах с прерванной (run-off) транскрипцией образуются продукты РНК определенных размеров. В этих экспериментах в качестве матрицы используют молекулы ДНК, расщепленные рестриктирующим ферментом внутри транскрибируемой последовательности. РНК-полимеразы, которые транскрибируют такую ДНК, достигая ее конца, останавливаются или «соскакивают». Если значительное число молекул фермента инициируют транскрипцию водном и том же сайте,то образуется популяция молекул РНК определенного размера. При электрофорезе такая популяция будет мигрировать в виде одной полосы. Если в качестве матриц в разных реакционных смесях использовать фрагменты ДНК, расщепленные различными ферментами рестрикции, путем сравнения размеров полученных РНК можно определить сайт начала транскрипции. Этот метод был широко использован в бесклеточных системах транскрипции для картирования эукариотических промоторов.

Размеры данного РНК-транскрипта можно просто и четко определить по методике Мак-Мастера и Кармикела [17], основными этапами которой являются денатурация РНК глиок-салем и последующий электрофорез в агарозном геле. Эта методика, подробно описанная в табл.3, удобна для анализа РНК з широком диапазоне размеров, причем расстояние, пройденное РНК, и lg молекулярной массы (для РНК от 0,2 kb до 5 kb и более) связаны линейной зависимостью. В примере, приведенном на рис. 1, РНК были транскрибированы с рекомбинант-ных плазмид, содержащих поздний промотор аденовируса и

Транскрипция генов эукариот в бесклеточных экстрактах

95

Таблица 3. Определение размеров РНК-транскриптов

1. Для приготовления раствора с глиоксалем смешайте:

270 мкл диметилсульфоксида

4,2 мкл, 1 ? фосфата натрия, рН 6,8

60 мкл деионизованного глиоксаля1

2. Присутствие большого количества рРНК в бесклеточном экстракте (разд. 2.1) ограничивает возможности электрофоретического анализа РНК, транскрибированной in vitro. Чтобы избежать перегрузки геля, обработку глиоксалем и электрофорез следует проводить только для одной четверти РНК, полученной в стандартной реакционной смеси объемом 25 мил (разд. 2.2), т. е. для 15 мкл из 60 мкл экстрагированной РНК (табл. 1, п. 10).

Смешайте:

15 мкл РНК (в растворе 0,2%-ного саркозила, 1 мМ ЭДТА, рН 8,0) 27 мкл раствора с глиоксалем Инкубируйте при 50 °С 1 ч.

3. Приготовьте 1,4%-ный агарозный гель (длиной 20 см и толщиной 0,3 см) на 10 мМ фосфате натрия, рН 6,8. Этот же буфер залейте в камеру для электрофореза.

4. После добавления бромфенолового синего нанесите каждую пробу обработанной глиоксалем РНК в отдельную лунку (0,6X0,3 см) агарозного. геля. В другую лунку в качестве маркеров нанесите предварительно обработанные глиоксалем РНК с подходящей молекулярной массой2.

5. Проводите электрофорез при 120 В 2,5 ч, обеспечив быструю рециркуляцию форезного буфера в камере, чтобы избежать изменения рН. При этом напряжении получают оптимальные результаты; при более низком напряжении и, следовательно, боле