сновном известны, оказались особенно ценными для выявления и дальнейшей очистки факторов транскрипции и трансляции. Целые же клетки можно использовать для подобного анализа только в исключительных случаях, например, когда в нашем распоряжении имеются клетки, не обладающие определенным фактором, и клетки другого типа, из которых этот фактор можно выделить. Недостаток бесклеточных систем заключается в том, что число этапов генной экспрессии, которые можно в них исследовать, ограничено. Кроме того, эффективность каждого этапа в этих системах может быть в 102—105 раз ниже, чем при инъецировании в клетки. Получение большей эффективности важно потому, что результаты исследования контроля того или иного этапа генной экспрессии становятся более достоверными, если условия на этом этапе! близки к нормальным, а не таковы, что эффективность составляет 1% от уровня in vivo. В заключение следует отметить, что эффективность генной экспрессии необходимо знать для тех экспериментальных систем, которые используются для анализа регуляции генной экспрессии; при анализе механизма генной, экспрессии этот вопрос не столь существен.

За последние годы экспериментальные системы были значительно усовершенствованы: увеличилось как разнообразие, так и эффективность исследуемых этапов экспрессии генов. Более того, системы и их источники стали гораздо более разнообразны. Поэтому я полагаю, что настоящий сборник будет полезен широкому кругу исследователей. Его главы написаны учеными, обладающими большим опытом работы с применением описанных методов, а в большинстве случаев непосредственно участвовавшими в их разработке.

ГЛАВА 1

ЭКСПРЕССИЯ ЭКЗОГЕННОЙ ДНК В КЛЕТКАХ МЛЕКОПИТАЮЩИХ

Д. Спандидос, Н. Уилки

1. Введение

Введение изолированной ДНК в клетки млекопитающих, растущие в культуре (перенос генов с помощью ДНК), стало одним из наиболее мощных инструментов для анализа экспрессии эукариотических генов. В настоящее время этот подход используется для идентификации и анализа сигналов регуляции транскрипции в геномах эукариот, для исследования сплайсинга РНК, для анализа механизмов генной модуляции в процессе дифференцировки и под действием таких регуляторов, как гормоны для идентификации и исследования клеточных онкогенов, связанных с канцерогенезом. В этой главе описаны методы, применяемые в настоящее время для переноса генов с помощью ДНК в клетки млекопитающих, растущие в культуре, и проиллюстрировано применение этого подхода для анализа экспрессии генов.

Существует несколько методов введения изолированной ДНК в клетки млекопитающих, растущие в культуре; эти методы описаны в разд. 2. Наиболее широко применяется кальций-фосфатная методика трансфекции, хотя в некоторых случаях предпочтительными могут оказаться другие способы (разд. 2.7). Применяя кальций-фосфатный метод, можно использовать до-норную ДНК практически любого происхождения (в том числе фаговые частицы или целые хромосомы), а экспрессию генов в реципиентных клетках можно определять или после короткого периода установления равновесия (временная экспрессия), или после превращения клеточной культуры в стабильно трансформированную. Если донорная ДНК кодирует какой-либо маркер, по которому может производиться отбор, то стабильно трансформированные клетки легко получить, используя для культивирования подходящие селективные среды. Соответствующие подходы описаны в разд. 2.1, где рассматривается применение кальций-фосфатной методики для широко используемого селектируемого маркера — гена тимидинкиназы (tk) вируса простого герпеса типа 1 (HSV-1) и ТК~-мутантных клеток в качестве реципиентов. Применение других селектируемых маркеров описано в общих чертах в разд. 3. Если донорная ДНК не содержит подходящего маркерного гена, то ее смеши-

Экспрессия экзогенной ДНК в клетках млекопитающих

II

вают с другой ДНК, несущей такой маркер, и проводят совместную трансформацию. После отбора по этому маркеру трансформированные клетки можно проверить на коэкспрессию генов, содержащихся в первой ДНК (разд. 2.1.8).

Упомянутые методики, в которых для трансфекции используется изолированная ДНК, можно рассматривать как векторные системы на основе ДНК. Яоскольку эти системы применяются в настоящее время наиболее широко, им посвящена значительная часть данной главы. Альтернативный метод основан на использовании вирусов эукариот в качестве векторов для нужной ДНК и он находит все более широкое применение. Такие векторы на основе вируса кратко описаны в разд. 4. Наконец, в разд. 5 этой главы рассмотрена экспрессия перенесенных генов в реципиентных клетках и изложены подходы, которые используются в сочетании с системами генного переноса для анализа регуляции экспрессии генов в эукариотических клетках.

Более специфические методы — микроинъекция экзогенной ДНК в ооциты Xenopus и применение таких систем для изучения генной экспрессии — описаны в гл. 2.

2. Методы введения ДНК в клетки млекопитающих

Без использования специальных методик введение экзогенной ДНК в клетки млекопитающих и ее экспрессия происходят с малой эффективностью. Попытки увеличить биологическую активность выделенных генов привели к разработке разнообразных методов повышения эффективности включения ДНК и ее последующей экспрессии. Они описаны в следующих разделах.

2.1. Кальций-фосфатная методика трансфекции

Кальций-фосфатный метод введения генов в клетки млекопитающих был впервые описан в работе [1] и в настоящее время используется наиболее широко. Он применяется для введения любой ДНК в клетки млекопитающих как при исследовании временной экспрессии, так и для стабильной трансформации (разд. 5). В общих чертах метод состоит в следующем. Экзогенную ДНК смешивают с хлористым кальцием и затем добавляют к раствору, содержащему фосфатные ионы. В результате происходит соосаждение ДНК с фосфатом кальция, образующийся осадок легко проникает в культивируемые клетки млекопитающих, и затем происходит эффективная экспрессия экзогенного гена.

Со времени появления этой методики возникло несколько ее модификаций. По опыту авторов для решения большинства

12

Глава 1

Amp

Рис. 1. Рестрикционная карта рекомбинантной плазмиды рТК1, на которой показаны нуклеотидные последовательности, участвующие в регуляции экспрессии гена tk. Эта плазмида содержит ген tk HSV-1, клонированный в плазмиде рАТ153 [2]. Пунктирная линия отвечает плазмиде рАТ153, сплошные линии — последовательностям ДНК HSV-1; жирной полоской обозначена кодирующая часть последовательности гена, заштрихованной — некоди-рующая. Три регуляторные последовательности, расположенные слева от кэп-участка, обозначены как проксимальный, первый дистальный и второй дистальный сигналы [3]. Все нуклеотиды пронумерованы в соответствии с их расположением относительно кэп-участка. Карты изображены без соблюдения масштаба. E — EcoRl, ? — Hindlll, Рч — PvuU, Sm — Smal, Bg — BglU, В — ВатШ. Amp — бактериальный ген ?-лактамазы, сообщающий устойчивость к антибиотику ампициллину. AATAA —каноническая последовательность для сигнала полиаденилирования в эукариотических клетках.

задач наилучшим является способ, описанный в табл. 1. Рассмотрена трансформация L-клеток мыши, дефицитных по ти-мидинкиназе (LATKr-клеток), путем введения в них ДНК, содержащей tk-тея плазмиды рТК1 (рис. 1). Уточним некоторые моменты этой методики.

1 Донорную ДНК в концентрации 40 мкг/мл в буфере 1 мМ трис-НС1, 0,1 мМ ЭДТА, 0,25 ? СаС12, рН 8,0 при постоянном перемешивании медленно добавляют к равному объему 2XHBS. Обычно в течение 30 с смешивают 1 мл ДНК и 1 мл буфера. Если в качестве донорной ДНК используются небольшие количества вирусной ДНК или клонированных генов, то необходимо добавить ДНК-носитель, чтобы концентрация суммарной ДНК составила 20 мкг/мл.

Экспрессия экзогенной ДНК в клетках млекопитающих

13

Таблица 1. Кальций-фосфатная методика переноса генов1

Эта методика рассмотрена на примере трансформации ЬАТК~-клеток мыши путем введения ДНК, содержащей tk-тен, например плазмиды рТК1 (рис. 1).

1. Приготовьте следующие растворы: 2xHEPES-coAeeou раствор (2XHBS)

1,63 г NaCl 1,19 г HEPES 0,023 г Na2HP04-2H20 Дистиллированная вода до 100 мл Доведите рН до 7,1, добавив 0,5 ? NaOH Простерилизуйте раствор фильтрованием и храните при 4°С. Конечные концентрации компонентов в 2xHBS:0,28 ? NaCl, 1,5 мМ Na2HP04, 50 мМ HEPES, рН 7,1. 2,5 ? CaCh

Растворите 10,8 г СаС12-6Н20 (Analar) в 20 мл (конечный объем) дистиллированной воды, простерилизуйте фильтрованием и храните при 4 °С. 0,1 мМ ЭДТА, 1,0 мМ трис-HCl, рН 8.0 Смешайте 50 мкл 0,2 ? ЭДТА, рН 8,0, и 100 мкл 1,0 ? трис-HCl, рН 8,0, с дистиллированной водой до конечного объема 100 мл. Простерилизуйте раствор фильтрованием и храните при 4 °С.

2. Соберите экспоненциально растущие ЬАТК~-клетки, используя трипсини-зацию.

3. Вновь рассейте клетки при плотности Ы06 клеток на флакон (площадь роста 25 см2), в который налито 5 мл свежей подогретой среды2 [среда SF12 (Flow Laboratories), содержащая 15% сыворотки Hyclone (Sterile Systems Inc.)]. Проинкубируйте 24 ч при 37 °С.

4. Внесите 0,5 мл донорной ДНК (например pTKl, см. рис. 1) вместе с ДНК-носителем (если потребуется) в маленький пластиковый флакон. Концентрация суммарной ДНК 80 мкг/мл, буфер — 0,1 мМ ЭДТА, 1,0 мМ трис-HCl, рН 8,0. Добавьте 0,4 мл 0,1 мМ ЭДТА, 1,0 мМ трис-HCl рН 8,0, и 0,1 мл 2,5 ? СаС12. Перемешайте.

5. Медленно (~30 с), при непрерывном перемешивании, добавьте этот раствор ДНК к 1 мл 2xHBS во второй маленький флакон. Сразу перемешайте смесь встряхиванием и оставьте ее при комнатной температуре на 30 мин. Конечная концентрация ДНК должна быть равна 20 мкг/мл.

6. После инкубации образуется тонкий осадок. Добавьте по 0,5 мл этой ДНК-кальций-фо.сфатной суспензии к каждому флакону, содержащему клетки в 5 мл ростовой среды.

7. Проинкубируйте чашки при 37 °С в течение 24 ч для того, чтобы клетки абсорбировали ДНК-кальций-фосфатный преципитат.

8. Стадия экспрессии, предшествующая селекции. Замените среду свежей подогретой средой и проинкубируйте при 37 °С еще 24 ч для того, чтобы произошла экспр