еклянном капилляре минимум 5 ч. Чтобы выбрать точную температуру гибридизации, нужно провести предварительные эксперименты, но во многих случаях считается приемлемой температура 70°С. В гибридизационную смесь можно ввести 50%-ный фор-мамид (деионизованный так, как описано в табл. о), что позволит снизить, температуру гибридизации до ~42°С. При использовании формамида. нуклеиновые кислоты перед гибридизацией нужно осадить этанолом (табл. 3, пп. 8 и 9), чтобы удалить остаточный формамид, который будет оказывать ингибирующее действие в последующих реакциях наращивания затравки. Осадок нуклеиновых кислот ресуспендируйте в 10 мкл 1-кратного гибридизационного буфера. Наконец, в гибридизационную смесь при необходимости можно добавить ДСН до конечной концентрации 1% для ингибирования РНКазы.

4. После гибридизации разбавьте 10 мкл гибридизационной смеси в 80 мкл «основной смеси» в силиконизированной пробирке от микроцентрифуги. Состав «основной смеси»:

10 мМ ДТТ 6 мМ MgCl2 25 мкг/мл актиномицина D по 0,5 мМ dATP, dGTP, dTTP, dCTP 50 мМ трис-HCl, рН 8,2

5. Добавьте 5 ед. обратной транскриптазы вируса птичьего миелобластоза! (AMV).

6. Проинкубируйте 1 ч при 42 °С.

7. Добавьте 0,1 объема ЗМ ацетата натрия, рН 5,6. Перемешайте и экстрагируйте одним объемом смеси фенол — хлороформ (1 : 1).

8. Отберите водную фазу и осадите нуклеиновую кислоту добавлением 2,5 объемов этанола с последующим центрифугированием и высушиванием осадка (табл. 3, пп. 8—10).

9. Растворите осадок в соответствующем объеме буфера для электрофореза и проведите электрофорез в 12%-ном полиакриламидном «секвенирующем» геле (разд. 3 работы [29]).

соответствующий 5'-концу РНК-транскрипта. Существует несколько рабочих модификаций основной методики Sl-нуклеаз-ного картирования с применением меченых радиоактивных ДНК-зондов. Методика, которой пользуемся мы, описана в табл. 6, а соответствующий пример показан на рис. 5. Альтернативный метод излагается в гл. 5, табл. 10.

?4

Глава 2

В методе наращивания затравки метят 5'-конец короткого фрагмента (30—80 bp) ДНК, соответствующего последовательности вблизи ожидаемого кэп-сайта исследуемого гена, и затем проводят очистку одиночных цепей, комплементарных РНК-транскрипту, на денатурирующем «секвенирующем» геле. Далее очищенную цепь гибридизуют с РНК-транскриптами и наращивают в присутствии немеченых дезоксирибонуклеотидов и обратной транскриптазы. Процесс наращивания продолжают до тех пор, пока не будет достигнут 5'-конец транскрипта. Размеры меченой достроенной затравки можно точно определить, используя денатурирующий «секвенирующий» гель. Таким образом точно идентифицируется б'-конец транскрипта. Рабочая методика наращивания затравки приводится в табл. 7.

Вероятно, наращивание затравки — более подходящий метод для точной локализации сайта кэпирования, поскольку при правильном выборе затравки наращенные сегменты будут относительно короткими, и, следовательно, их размер можно точно определить методом гель-электрофореза. Достроенную затравку можно также секвенировать методом Максама — Гилберта [29]. Однако, если положение сайта кэпирования неизвестно, лучше использовать Sl-нуклеазное картирование, поскольку при этом не требуется разделения цепей, которое зачастую является весьма трудным делом.

3. Идентификация З'-конца РНК-транскрипта. Наращивание затравки из-за полярности этого процесса нельзя использовать для индентификцаии З'-конца транскрипта. Для этой цели подходит только картирование с помощью нуклеазы S1. Этот метод используется точно в таком виде, в каком он описан в табл. 7, за исключением того, что ДНК-зонд должна иметь радиоактивно меченный З'-конец. Мечение проводят, используя фрагмент Кленова ДНК-полимеразы I и [а-32Р]-дезоксину-клеозидтрифосфаты [29]. Примеры применения этого метода описаны в работе [19].

5.3. Идентификация РНК-полимераз, участвующих в транскрипции

Три эукариотические РНК-полимеразы по-разному ингиби-руются грибным токсином ?-аманитином. Активность РНК-полимеразы II подавляется при концентрации 1 мкг/мл, РНК-полимеразы III — при концентрации 100 мкг/мл, а РНК-полимераза I остается активной вплоть до концентрации 1 мг/мл. Это позволяет использовать ?-аманитин для идентификации фермента, осуществляющего транскрипцию специфических типов РНК в ооцитах после инъекции. При совместной инъекции в ооциты ?-аманитина в концентрации 40 мкг/мл и ДНК тран-

Экспрессия экзогенной ДНК в ооцитах Xenopus

85

скрипция при участии РНК-полимеразы II будет полностью подавлена, а введение ?-аманитина в концентрации 100 мкг/мл лриведет к снижению синтеза тРНК и 5S-pPHK на 90%.

6. Анализ посттранскрипционного процессинга

Некоторые особенности ооцитов Xenopus позволяют проводить на них тонкие исследования посттранскрипционного процессинга. Во-первых, в ядре ооцита может осуществляться правильный процессинг первичных транскриптов [17, 19]. Во-вторых, благодаря большим размерам ядра облегчается инъекция ДНК и удается инъецировать также РНК, которая подвергается процессингу в ооците. Таким образом, можно пойти как бы в обход транскрипции. Наконец, быстрое разделение вручную ядра и цитоплазмы позволяет отличать процессинг, идущий в ядре, от процессинга, идущего в цитоплазме [17].

Существует несколько типов посттранскрипционного процессинга: присоединение остатков 7-метилгуанозина к 5'-концам многих первичных транскриптов («кэпирование»), полиаденили-рование, процессивная терминация и сплайсинг.

На сегодняшний день наибольших успехов в исследовании "посттранскрипционных процессов с помощью ооцитов Xenopus удалось достичь в анализе сплайсинга РНК. Положения 5'- и З'-сайтов сплайсирования, участвующих в образовании зрелого транскрипта, можно определить с помощью Sl-нуклеазного картирования, используя зонды, меченные соответственно по 3'- и 5'-концам (см. разд. 5.2.2, п. 2 и 5.2.2, п. 3). В работе [19] была проведена количественная оценка нормального сплайсинга РНК, транскрибированных с инъецированных матриц. Однако для детального анализа механизмов сплайсинга РНК процессы транскрипции и процессинга нужно разделить. Лучше всего это сделать путем инъекции предшественника мРНК в ядро ооцита. Такой анализ был выполнен в работе [30] на предшественнике мРНК Для ?-глобина человека с использованием системы in vitro для получения больших количеств предшественника мРНК. Читателю лучше ознакомиться с самой работой, где описаны эти методы, поскольку мы не имеем опыта выбора необходимых систем транскрипции.

Наконец, говоря о терминации, нужно отметить, что, хотя З'-концы РНК транскриптов удается индентифицировать (разд. 5.2.2, п. 3), они, по-видимому, не соответствуют сайту терминации генов, транскрибируемых РНК-полимеразой II, поэтому необходимо установить аутентичный сайт терминации. Ооцит безусловно окажется великолепной системой для изучения требований, предъявляемых к последовательностям при терминации, и участия в ней других факторов (разд. 8).

86

Глава 2

? /

Рис. 6. Исследование сопряженной транскрипции — трансляции. В ооциты инъецировали ре-комбинантную ДНК, содержащую последовательности кДНК овальбумина цыпленка. После инкубации в течение 24 ч в нерадиоактивной среде был добавлен [355]-метионин и инкубацию проводили еще 24 ч. Затем были выделены следующие фракции: инкубационная среда (дорожка 1), цитозоль (дорожка 2) и мембраны (дорожка 3). Проведены иммунопреципитация этих фракций антиовальбуминовыми антителами и электрофорез (гл. 10, разд. 5.5). Эти данные четко указывают на присутствие овальбумина в мембране и в секретируемом (инкубационная среда) материале.

7. Использование системы ооцитов для исследований сопряженной транскрипции — трансляции

В гл. 10 описаны достоинства ооцита как системы для исследования трансляции инъецированной мРНК. По многим причинам эта система имеет преимущества перед другими и при исследовании сопряженной транскрипции — трансляции. Во-первых, в тех случаях, когда in vivo уровень экспрессии гена очень низок, инъецированная в ооциты Xenopus клонированная ДНК может быть выведена из-под нормального контроля. Это может привести к синтезу большего количества белка и, таким образом, облегчит биохимическое изучение продукта инъецированного гена. Во-вторых, внося мутации в ДНК in vitro и инъецируя ее затем в ооциты Xenopus, можно определять последовательности ДНК, важные для внутриклеточной компартментализации, активности ферментов и т. п.

Методы радиоактивного мечения белковых продуктов в ооцитах Xenopus и их последующий анализ описаны в разд. 4.2 этой главы, а более всесторонне — в гл. 10 (разд. 4). Пример такой сопряженной системы представлен на рис. 6, где в ядра

Экспрессия экзогенной ДНК в ооцитах Xenopus

87

ооцитов была инъецирована ДНК, содержащая последовательность полноразмерной кДНК овальбумина цыпленка. Не надо забывать две потенциальные проблемы, связанные с использованием системы ооцитов для изучения сопряженной транскрипции — трансляции. Во-первых, мы, а также другие исследователи [11] обнаружили, что трансляция мРНК, соответствующей инъецированной ДНК, в ооцитах существенно различается для разных партий ооцитов. Поэтому по возможности нужно повторно использовать лягушек, для ооцитов которых наблюдался высокий уровень продуктов трансляции инъецированной ДНК (гл. 10, разд. 2.2.1). Во-вторых, накопление продукта трансляции, по-видимому, очень сильно зависит от концентрации инъецируемой ДНК (J. Davey, A. Wilson, частное сообщение). Таким образом, хотя мы работали с концентрациями ДНК, рекомендуемыми в разд. 3.4, использование более высоких концентраций (например, 1 мг/мл) может в случае некоторых ДНК привести к снижению синтеза белка. Причина этого не ясна.

8. Исследование регуляторных белков

Ооцит Xenopus является отличным объектом для изучения транскрипции и посттранкрипционных процессов, осуществляющихся после инъекции определенных ДНК или РНК- Совсем недавно в этой работе были достигнуты новые успехи: изучено влияние белков на инициацию [31] и на терминацию [32] транскрипции с использованием в качестве матрицы инъециров