елав в ней ямкн пастеровской пипеткой.

3. Если инъекция была сделана в ядро, оно будет иметь темно-голубую окраску. Если вы промахнулись, то ядро останется прозрачным, а в цитоплазме появится диффузно окрашенная область. После некоторой практики частота попаданий достигает 80%.

3.6.2. Метод центрифугирования

Этот метод описан в табл. 2 и проиллюстрирован схематически на рис. \,Б. На рис. 2 показано, как выглядят ооциты после центрифугирования перед микроинъекцией. Отметим, что, хотя этот метод облегчает инъекцию ДНК в ядро ооцита, у него есть тот недостаток, что ядро легко проколоть насквозь, поскольку при центрифугировании оно значительно уплощается.

74

Глава 2

Рис. 2. Ооциты после центрифугирования. Во время центрифугирования ядро перемещается в верхнюю часть ооцита. Если перед центрифугированием ооцит расположен правильно, пигментированной половиной вверх (рис. 1,5), то ядро можно выявить по положению бледного участка на верхушке пигментированной поверхности. Как видно из фотографии, когда ооцит расположен неправильно, местоположение бледного участка может быть другим.

4. Радиоактивное /лечение ооцитов после инъекции

4.1. /Лечение РНК, транскрибированной на инъецированной ДНК

Во многих случаях лучше метить РНК-транскрипты [а-32Р]-нуклеотидами, а не [3Н]-нуклеозидами или [3Н]-нуклеотидами, поскольку [32Р]-транскрипты можно исследовать более разнообразными методами. Не исключено, однако, что имеющиеся теперь [35S] -нуклеотиды заменят соединения, меченные [32Р], поскольку время полураспада у [35S] больше, чем у [32Р]. К сожалению, ооциты Xenopus, будучи проницаемы для нуклеозидов, непроницаемы для нуклеотидов. Поэтому [32Р]-нуклеотиды (обычно [a-32P]-GTP или [сс-32Р]-СТР) нужно инъецировать в ооциты для того, чтобы пометить транскрипты. Существуют две различные прописи.

1. Нуклеотиды, меченные [32Р], инъецируют вместе с ДНК (табл. 2) в объеме приблизительно 50 нл при концентрации 10—20 мКи/мл (>400 Ки/ммоль). Это означает, что вводится примерно 2,5 пмолей нуклеотидов на ооцит, т. е. в ~10 раз больше, чем размеры эндогенного пула [25]. При таком коли-

Экспрессия экзогенной ДНК в ооцитах Xenopus

75

честве введенной метки включится около 50 000 расп/мин в РНК ооцита в течение 24 ч. Поскольку ооциты после инъекции сохраняют жизнеспособность в течение нескольких суток, а инъецированная ДНК становится эффективной матрицей для транскрипции только после образования хроматина, имеет смысл выдержать ооциты в течение 24 ч после совместной инъекции ДНК и нуклеотида, меченного [32Р].

2. Нуклеотиды, меченные [32Р], вводят через 24 ч после инъекции ДНК (табл. 2). Хотя эксперимент становится более трудоемким, в этом случае нет необходимости вводить нуклеотиды в ядро, поскольку между ядерным и цитоплазматическим пулами быстро устанавливается равновесие. Поэтому вторую инъекцию можно сделать в цитоплазму (см. гл. 10, разд. 3.3.3). Преимущество этого метода заключается в том, что радиоактивный предшественник включается более активно, чем в случае совместной инъекции, описанной выше (разд. 4.2).

4.2. Мечение белков, кодируемых инъецируемой ДНК

В гл. 10, разд. 4, обсуждаются различные аспекты мечения новосинтезированных белков в ооцитах Xenopus. Когда инъецированный ген кодирует полиаденилированную мРНК, то выход соответствующего белка должен быть больше, если мечение проводить спустя 24 ч после инъекции ДНК. В течение этого периода происходит накопление полиадеиилированной мРНК, а нестабильные неполиаденилированные транскрипты не накапливаются (см. гл. 10, разд. 3.3).

Как и в случае мечения РНК-транскриптов (разд. 4.1), существуют две разные прописи для мечения белковых продуктов.

1. Поскольку ооциты проницаемы для аминокислот, можно просто добавлять радиоактивные аминокислоты в инкубационную среду, откуда они будут включаться в белок ооцита. Обычно концентрация радиоактивной аминокислоты составляет 0,1—5,0 мКи на 1 мл инкубационной среды (гл. 10, разд. 4.2).

2. В другом варианте радиоактивную аминокислоту (50 нл, 10 мКи/мл) инъецируют в цитоплазму ооцита (гл. 10, разд. 4.5).

Анализ меченых белков можно проводить так, как это описано в гл. 12 (разд. 5).

5. Анализ РНК-транскриптов

5.1. Выделение РНК

1. В конце периода инкубации проверьте ооциты в культу-ральных чашках. Отберите только ооциты, жизнеспособные на вид (см. гл. 10, рис. 9, где помещены фотографии жизнеспособ-

76

Глава 2

Таблица 3. Выделение РНК из ооцитов после инъекции

1. Вариант для целых ооцитов. Гомогенизируйте ооциты при концентрации 10—30 ооцит/мл в 1%-ном ДСН, 1,5 мМ MgCl2, 10 мМ NaCl, 1 мг/мл протеиназы К (Calbiochem), 10 мМ трис-HCl, рН 7,6 [16]. Перед использованием этот буфер должен быть предварительно проинкубирован при 37 "С. Вариант для раздельного анализа ядерной и цит о плазматической РНК из индивидуальных ооцитов (см. разд. 5.1, п. 3). Проведите энуклеацию каждого ооцита, используя метод 1, описанный в гл. 10, разд. 6.1.1. Затем гомогенизируйте по отдельности ядерную и цитоплазма-тическую фракции в буфере, описанном выше (0,1 мл на 10 ядер или 1,0 мл на цитоплазму 30 ооцитов), содержащем также 100 мкг/мл тРНК Е. coli в качестве носителя, в случае ядер.

2. Проинкубируйте при комнатной температуре 20 мин.

3. Добавьте 4 ? NaCl до конечной концентрации 0,3 М.

4. Добавьте равный объем смеси фенол — хлороформ 1:1 (по объему), заранее насыщенный буфером для гомогенизации.

5. Перемешайте в течение 10 с и затем отцентрифугируйте при 10 000g 1 мин.

6. Отберите верхнюю водную фазу и вновь экстрагируйте органическую фазу вместе с интерфазой 0,1 объемом 0,3 ? NaCl, 10 мМ трис-HCl, рН 7,6. Перемешайте и отцентрифугируйте согласно п. 5.

7. Объедините две водные фазы, получившиеся в п. 5 и 6, и повторно экстрагируйте их равным объемом смеси фенол — хлороформ согласно пп. 4 и 5.

8. К объединенным водным фазам добавьте 2,5 объема этанола и оставьте на ночь при —20 °С.

9. Осадите РНК центрифугированием 10 000 g 2 мин.

10. Высушите осадок РНК под вакуумом и растворите его в нужном буфере. Выбор буфера зависит от метода анализа. В случае необходимости раствор ДНК можно хранить при —20 °С.

ных и нежизнеспособных ооцитов). Промойте ооциты в модифицированном солевом растворе Барта.

Далее используйте один из двух способов. Первый способ. Для анализа суммарной РНК ооцита гомогенизируйте ооциты и выделите РНК методом, описанным в табл.3. Мы предпочитаем использовать для этой цели незамороженные ооциты, хотя есть данные по предварительному замораживанию ооцитов в сухом льду ;[17].

Второй способ. Для раздельного анализа ядерной и цитоплаз-матической РНК энуклеируйте каждый ооцит методом, описанным в гл. 10 (разд. 6.1.1). Поскольку может происходить арте-фактный переход ядерных транскриптов в цитоплазму некоторых ооцитов, рекомендуется анализировать ядерную и цито-плазматическую РНК каждого ооцита индивидуально [19]. Такое «просачивание» можно обнаружить по присутствию 405-предшественника рибосомной РНК в цитоплазматических экстрактах. РНК выделяют из индивидуальных ядер и цитоплазмы так, как это описано в табл. 3. На практике такие предосторожности имеют смысл только в случае выделения меченых РНК-транскриптов.

Экспрессия экзогенной ДНК в ооцитах Xenopus

77

5.2. Характеристика РНК-транскриптов

5.2.1. Меченые РНК-транскрипты

РНК, меченую так, как это описано в разд. 4.1 и выделенную методом, приведенным в табл. 3, можно проанализировать либо сразу, с помощью электрофореза в геле, либо после предварительной гибридизации на фильтрах, содержащих специфические фрагменты ДНК, и элюции с них. Последний метод описан в табл. 4. Результаты анализа такого рода представлены на рис. 3.

Таблица 4. Анализ специфических транскриптов методом элюции гибридов

1. Растворите комплементарную ДНК (в двух- или одноцепочечной форме) в воде и прогрейте при 100 "С 10 мин. Быстро охладите во льду.

2. Профильтруйте ДНК через нитроцеллюлозный фильтр (HAWP; 1,3 см диаметром) и затем прогрейте фильтры при 80 °С 2 ч.

3. Поместите каждый фильтр на плоское дно пластикового флакона для сцинтилляционного счетчика. Добавьте 20—100 мкг РНК ооцитов на 200 мкл раствора 0,4 ? NaCl, 0,2%-ного ДСН, 10 мМ PIPES (рН 6,4). Проинкубируйте при 50 °С 2 ч.

4. Промойте каждый фильтр шесть раз по одной минуте в 1XSSC1 при 60 "С, дважды в 0,2xSSC при 60 °С и затем один раз в 5 мМ NaCl, 2 мМ ЭДТА, 20 мМ трис-HCl рН 7,7 при 50 °С.

5. Элюируйте гибридизовавшиеся РНК-транскрипты, проведя две последовательные инкубации в течение 1 мин при 100 °С в 0,2 мл воды. Элюаты объедините. Добавьте 10 мкг тРНК Е. coli в качестве носителя и 2,5 объема этанола для осаждения нуклеиновой кислоты (табл. 3, п. 8).

6. Осадите нуклеиновую кислоту и растворите ее в буфере (табл. 3, пп. 9 и 10), прежде чем проводить электрофорез в полиакриламидном геле (см., например, гл. 4, табл. 8) или использовать метод трансляции (гл. 8, разд. 2.6.2).

1 1XSSC —буфер следующего состава; 0,15 ? NaCl, 15 мМ цитрат натрия (трехза. мещенный).

5.2.2. Немеченые РНК-транскрипты

В альтернативном варианте после инъекции ДНК ооциты инкубируют в отсутствие радиоактивного нуклеотида. После экстракции РНК методом, описанным в табл. 3, немеченые РНК-транскрипты можно проанализировать различными способами.

1. Норсерн-блоттинг. Этот метод, описанный подробно в табл. 5, включает электрофорез РНК-транскриптов в агароз-ном геле с последующим переносом РНК на нитроцеллюлозный фильтр. Затем РНК на фильтре инкубируют в присутствии соответствующей меченой денатурированной ДНК-зонда, с которой нужные РНК-транскрипты гибридизуются. Этот метод

Н4

к

Рис. 3. Синтез РНК в ооцитах. А. В ооциты инъецируют дистиллированную воду (дорожка 1), ДНК Xenopus, кодирующую 5S-pPHK (дорожка 2), или ДНК Xenopus, кодирующую тРНК (дорожка 3). Одновременно инъецируют [3H]-GTP. После инкубации в течение 24 ч РНК экстрагируют так, как описано в табл. 3, и анализируют методом электрофореза в 15%-ном полиакрил-амидном геле с последующей флюорографией. Б. В ооциты одновременно инъецируют ДНК гистона Н4 X