Биологический каталог




Транскрипция и трансляция. Методы

Автор Б.Хеймс, С.Хиггинс

ВА 2

ЭКСПРЕССИЯ ЭКЗОГЕННОЙ ДНК В ООЦИТАХ XENOPUS

А. Колмен

1. Введение

Ядро ооцита содержит достаточное количество трех эукариотических РНК-полимераз, чтобы удовлетворить потребности развивающегося эмбриона по крайней мере до стадии 30 000 клеток. Этот материнский запас может использоваться также для транскрипции экзогенной ДНК, инъецированной в ядро ооцита. Впервые это продемонстрировали Гер дон и Мерц в 1977 г. [I]1'. В этих начальных экспериментах было показано только, что инъецированные ДНК действительно транскрибируются. Однако в ходе последующих опытов по инъекции ДНК, кодирующей 5S-pPHK, было установлено, что инициация и терминация транскрипции экзогенной ДНК осуществляются правильно [3]. Вслед за этим было проведено множество экспериментов по инъекции ДНК (см. обзоры [4—6]); некоторые из них перечислены в табл. 1. Их результаты можно суммировать следующим образом.

1. Транскрипты, синтезируемые РНК-полимеразой III. Вскоре после четкой демонстрации успешной транскрипции с помощью РНК-полимеразы III инъецированных генов 5S-pPHK были получены столь же четкие результаты с генами тРНК [16]. Более того, было показано, что сложные посттранскрипционные изменения (например, модификация оснований, процессинг и в некоторых случаях сплайсинг РНК), в норме осуществляющиеся при созревании этих первичных тРНК-транскриптов, происходят также и с продуктами транскрипции тРНК-генов, инъецированных в ооциты [17]. Было даже установлено, что может происходить правильный процессинг очищенных предшественников тРНК, инъецированных в ооциты [6].

2. Транскрипты, синтезируемые РНК-полимеразой II. Когда инъецируют белок-кодирующие гены, не имеющие интронов (например, гистоновые гены), часть актов транскрипции с помощью РНК-полимеразы II начинается и заканчивается в правильных сайтах и стабильный транскрипт поступает в цитоплаз-му, где происходит его трансляция [12]. Неправильные транс-

1 Ранее [2] была показана специфическая транскрипция ДНК, инъецированной в ооциты Xenopus, но место транскрипции в клетке не было идентифицировано.

5—953

66

Глава 2

Таблица 1. Транскрипция генов, инъецированных в ооциты Xenopus1

РНК-

? ? ртпи ???? Инъецирован- поли- Правильные Синтезируемые! Ссыл-

ДНК ный ген мера-за2 транскрипты? белки ки

Xenopus рДНК I Некоторые4 — [7]

SV40 Вирусная ДНК II 19S и 25S Вирусные белки и Т-ан-тигены 1й1

Вирус То же 11 19S и 25S То же [91 Г I С\Л

полиомы 1 rill

Аденовирус Полный вирусный геном II — Несколько ранних белков

Морской еж Гистоновые гены II Н2А, Н2В, НЗ Н2А, Н2В, НЗ [12] [??

Drosophila. То же 11 — Н2А [91 Г 1 Q l

Xenopus II Н4 Н4, Н2А, Н2В, НЗ, HI [i3j

Вирус Тимидинкиназ- II Некоторые4 Тимидинкиназа [14}

герпеса ный ген [15]

Цыпленок Овальбумино-вый ген II Овальбумин Xenopus 5S-pPHK III 5S-pPHK — [3]

Xenopus тРНК III тРНК и предшественники [16]

Дрожжи тРНК III То же — [17] ? 1 ??

Нематода » III — [17]

1 См. работу [6J, откуда с изменениями н дополнениями взята эта таблица.

2 Указанная РНК-полимераза в норме транскрибирует данный геи in vivo, но отсюда не следует, что именно она используется в ооцитах Xenopus.

3 Прочерк означает, что соответствующие данные отсутствуют в цитируемой работе. * Как показывает анализ с помощью нуклеазы S1, синтез некоторых транскриптов

инициируется правильно.

5 Транскрипты соответствующего размера не обнаружены.

крипты, особенно с некодирующей цепи, деградируют в ядре и никогда не поступают в цитоплазму. Экспрессия инъецированных белок-кодирующих генов, содержащих интроны, была менее эффективной [6]. Возможно, это обусловлено ошибками в инициации транскрипции или в сплайсинге (см. ниже).

Инициация транскрипции инъецированного в ооцит гена, в норме транскрибируемого РНК-полимеразой II, происходит не всегда; это зависит от свойств инъецированного гена. Причины этой вариабельности пока до конца не установлены; ясно лишь, что важнейшую роль играет структура 5'-фланкирующих участков изучаемого гена (D. A. Melton, частное сообщение). Тем не менее если инициация произошла, то, по-видимому, сайт инициации транскрипции инъецированного гена соответствует нормальному сайту инициации этого гена in vivo [18—20]. Эти данные стимулировали изучение последовательностей ДНК, расположенных в б'-направлении от сайта инициации транс-

Экспрессия экзогенной ДНК в ооцитах Xenopus

67

крипции и влияющих на инициацию. Так, в работах [18, 21] было четко выявлено несколько участков в ДНК морского ежа, расположенных перед сайтом инициации транскрипции гисто-новых генов, мутация в которых специфически влияет и на точное положение этого сайта (так называемый кэп-сайт), и на частоту инициации. Мак-Найт и Кингсбери [20] исследовали более тонкие эффекты модификации последовательности на транскрипцию тимидинкиназного гена вируса простого герпеса, используя систему конкуренции, когда немодифицированный ген и его модифицированные производные совместно вводили в ядра ооцитов. При такой системе обеспечивалась независимость наблюдаемых различий в экспрессии модифицированных генов от изменений объемов инъецированного материала, от различий между ооцитами и т. д. Более подробные методы, используемые для анализа инициации транскрипции, описаны в этой главе ниже.

Аналогичные подходы и аналитические методы использовались для идентификации и исследования областей, участвующих в терминации транскрипции, а также для идентификации З'-конца РНК-транскриптов [12, 19]. Однако особенность системы ооцитов состоит в том, что проверяются только установившиеся популяции транскриптов, и поэтому очень трудно определить, соответствуют ли 5'- и З'-концы транскриптов действительным сайтам инициации и терминации транскрипции.

Как говорилось выше, в опытах с использованием инъецированных генов тРНК было установлено, что в ядре ооцита происходит очень эффективный сплайсинг генов тРНК, содержащих интроны. Сейчас ясно, что сплайсинг происходит также и с транскриптами генов, транскрибируемых РНК-полимеразой II. Поскольку для генов, белок-кодирующие последовательности которых содержат интроны, были получены правильные продукты трансляции, это давало основания полагать, что какое-то количество РНК подвергается правильному сплайсингу {8, 15], однако лишь недавно этот вопрос был изучен детально [19]. Доля первичных транскриптов, подвергающихся правильному сплайсингу, варьирует, но сам факт, что правильный сплайсинг происходит с заметной эффективностью, позволяет исследовать влияние на него нуклеотидной последовательности.

3. Транскрипты, синтезируемые РНК-полимеразой I. Инъецированные в ооциты гены 18S- и 28S-pPHK успешно транскрибировались в них РНК-полимеразой I. Первым указанием на это послужило образование на инъецированной ДНК характерных транскрипционных комплексов [22], выявленных электронно-микроскопическими методами. Недавно были получены биохимические данные о наличии этой транскрипции и участии в ней РНК-полимеразы I [7].

68

Глава 2

Первым шагом на пути к четкой демонстрации экспрессии эукариотического гена на транскрипционном уровне явились опыты по инъекции генов 5S-pPHK в ядро ооцита [3, 23, 24]. Однако большая часть этой изящной работы была выполнена на бесклеточных системах, содержащих изолированные ядра Xenopus. Точно так же, по-видимому, бесклеточные системы транскрипции in vitro в принципе больше подходят для изучения регуляции транскрипции генов, транскрибируемых РНК-полимеразой II, поскольку уровень транскрипции инъецированных генов этого типа сильно варьирует от ооцита к ооциту. Тем не менее с помощью ооцитов было получено много данных о регуляторных последовательностях, участвующих в транскрипции определенных эукариотических генов, например гистоновых генов [12, 18, 21] и гена тимидинкиназы [20]. Более того, эта система все еще остается предпочтительной при исследовании сплайсинга и посттранскрипционного процессинга и транспорта, поскольку в бесклеточных системах, имеющихся в настоящее время, эти процессы не идут или идут слабо. По моему мнению, система ооцитов Xenopus будет и в дальнейшем применяться для изучения посттранскрипционного процессинга, а также в исследованиях сопряженной транскрипции — трансляции, где можно использовать преимущества ооцита как трансляционной системы (разд. 7).

2. Получение ооцитов и подготовка их к микроинъекции

Шпорцевые лягушки Xenopus laevis поставляются несколькими фирмами. Их содержат в лабораторных условиях в больших крытых баках с водой при 19—21 °С и кормят только два раза в неделю. Ооциты получают из зрелой самки Xenopus путем частичного или полного удаления яичника с последующим извлечением ооцитов из фолликулов — вручную или ферментативной обработкой. Преимущество частичной овариэктомии состоит в том, что при этом лягушка не погибает и ее можно повторно использовать в серии опытов. Более подробно о приобретении X. laevis и уходе за ними, а также о методах удаления ткани яичников и приготовления ооцитов для инъекции см. в гл. 10 (разд. 2).

3. Микроинъекция ДНК в ядра ооцитов

3.1. Необходимое оборудование

Оборудование, необходимое для микроинъекции ДНК в ядра ооцитов, состоит из стереомикроскопа, микроманипулятора, шприца, источника света, аппарата для вытягивания микропи-

Экспрессия экзогенной ДНК в ооцитах Xenopus

69

петок и микрокузницы. В гл. 10 (разд. 3) описаны критерии выбора подходящего оборудования, а также даны указания к изготовлению, калибровке и хранению микропипеток.

3.2. Конформация ДНК, используемой для инъекции

С помощью методов рекомбинантных ДНК в большинстве случаев ДНК для инъекции можно получить в кольцевой форме. Кольцевая ДНК является наилучшей матрицей [6]: при инъекции линейных молекул размером менее 5000 bp образуется в 10—20 раз меньше РНК, чем при инъекции таких же ДНК, в кольцевой форме, и зачастую транскрипция происходит неправильно. Если это воз

страница 15
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88

Скачать книгу "Транскрипция и трансляция. Методы" (6.57Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(21.03.2019)