ые для каждой кислоты или спирта. Порядок элюирования спиртов и летучих жирных кислот из газохроматографической колонки таков: этанол, «-про-панол, изобутанол, н-бутанол, изоамиловый спирт, н-пентанол, уксусная, муравьиная, пропионовая, изомас-ляная, н-масляная, изовалериановая, «-валериановая, пзокапроновая, н-капроновая и гептановая кислоты.

Метиловые эфиры нелетучих кислот элюируются в следующем порядке: эфир пировиноградной, молочной, щавелево-уксусной, щавелевой, метилмалоновой, малоновой, фумаровой и янтарной кислот.

Водород и метан

Образование водорода и метана определяют в культурах, выращенных в среде, содержащей глюкозу или другие сбраживаемые углеводы.

Пробирки с культурами закрывают резиновыми пробками и инкубируют. После того как культуры вырастут, из пространства над культуральной средой отбирают пробы газа, вводя иглу шприца через резиновые пробки. Для этого пользуются 1- или 5-мл пластмассовым шприцем одноразового пользования с иглой длиной 3,8 см. Иглу вводят между резиновой пробкой и стенкой пробирки, а если понадобится, и через пробку под углом, позволяющим ей войти в газовую фазу над культуральной средой. Отбирают 0,7—1,0 мл газовой фазы и вводят в газовый хроматограф.

Газовый хроматограф должен быть оснащен детектором по теплопроводности. В качестве газа-носителя используют азот или аргон со скоростью потока 25— 30 см3/мин. Колонку из алюминия или нержавеющей стали длиной 1,83 м и диаметром 0,64 см заполняют силикагелем (N 12, 80—100 меш; Supelco Inc., Bellefon-ie, Pa.). Температура термостата колонки 25—30°С; -если прибор оснащен раздельными термостатами дозатора и детектора, их устанавливают на ту же температуру, что и термостат колонки, или на несколько градусов выше. Стандарты для анализа газа продаются любой фирмой, поставляющей материалы для хроматографии. Для определения точки элюирования метана используют природный газ. В случае смеси водорода и метана водород элюируется из колонки раньше, чем метан.

20.2.2. Оптическое вращение молочной кислоты [7, 24]

К 10 мл культуры и 10 мл неинокулированной среды добавляют 0,2 мл 50%-ной (по объему) H2S04. Концентрацию молочной кислоты определяют (в миллиэквивалентах на 100 мл) методом газовой хроматографии и используют для этого 1 мл подкисленной культуры (разд. 20.2.1). Для определения оптического вращения по описанному ниже методу минимальная концентрация молочной кислоты должна быть 1 мэкв/100 мл.

Приготовление растворов хлорной кислоты, буфера, лактатдегидрогеназы и NAD описано в разд. 20.4.8.

Ь-( + )-Молочную кислоту и рабочий стандарт готовят следующим образом. К 5,0 мл подкисленной неино-кулированной среды добавляют 0,0296 г L-( + )-молочной кислоты (кальциевой соли) и 5,0 мл дистиллированной воды. 1,0 мл этого раствора добавляют к 1,0 мл хлорной кислоты. Центрифугируют и собирают надоса-дочную жидкость, которая является рабочим стандартом (1,0 мкмоль L-(-j-)-молочной кислоты в 0,1 мл).

К 1,0 мл подкисленной культуры добавляют 1,0 мл дистиллированной воды и 2,0 мл хлорной кислоты. Центрифугируют и отделяют надосадочную жидкость, которая служит образцом при определении оптического вращения.

К 1,0 мл подкисленной неинокулированной среды добавляют 1,0 мл дистиллированной воды и 2,0 мл хлорной кислоты. Смесь центрифугируют и отделяют надосадочную жидкость, которая является основным контрольным раствором.

Берут 7 стеклянных пробирок 12x75 мм. В пробирку 1 вносят 0,1 мл основного контрольного раствора. В пробирки 2—6 вносят соответственно 0,02; 0,04; 0,06; 0,08 и 0,10 мл рабочего стандарта молочной кислоты. Добавляют в каждую пробирку соответственно 0,08; 0,06; 0,04; 0,02 и 0,00 мл основного контрольного раствора и доводят объем жидкости до 0,10 мл. В пробирку 7 вносят 0,10 мл испытуемого образца. В каждую из семи пробирок добавляют последовательно по 3,0 мл буфера и 0,03 мл раствора лактатдегидрогеназы. Затем добавляют 0,1 мл раствора NAD, закрывают каждую пробирку парафильмом и осторожно переворачивают несколько раз для перемешивания растворов (пробирки не встряхивать). Инкубируют при 30°С в течение 60 мин, точно выдерживая время с момента добавления NAD в 1-ю пробирку.

В каждой пробирке измеряют оптическую плотность раствора при длине волны 340 нм. Если на используемом приборе нельзя снимать показания при этой длине волны, измеряют при длине волны, близкой к 340 нм, например в случае спектрофотометра Spectronic 20 (Bausch and Lomb, Inc., Rochester, N. Y.) устанавливают длину волны 366 нм. Пробирку 1 используют в качестве контроля при установке прибора на нуль. Снимают показания величины оптической плотности, точно соблюдая ту же последовательность, в которой добавляли NAD. Для снятия показаний пользуются одной и той же кюветой; после измерения содержимое кюветы выливают, кювету споласкивают и заполняют следующим раствором.

На миллиметровой бумаге строят график зависимости оптической плотности от количества L- ( + ) -молочной кислоты (0,0; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 и 1,0 мкмоль соответственно в пробирках 1—6). Калибровочную кривую проводят с максимальной точностью. На основе этой стандартной кривой определяют количество L-( + )-молочной кислоты в микромолях в испытуемой пробе (пробирка 7). Эту величину умножают на 4 и получают количество Ь-( + )-молочной кислоты в миллиэквива-лентах на 100 мл культуры. Вычисляют процент L-( + )-молочной кислоты по формуле:

мэкв /.-(-(-)-молочной кислоты (результат

мэкв молочной кислоты (общее содержание, определенное с помощью газовой хроматографии) в 100 мл

20.2.3. Системы комбинированного тестирования

В продаже имеется несколько удобных систем для быстрой идентификации различных групп бактерий, особенно сем. Enterobacteriaceae. Полную информацию по идентификации с помощью таких систем можно получить от фирм-изготовителей. Там же можно получить бланки для фиксирования результатов: таблицы, системы кодирования или характеристичные профили, разработанные для этих систем. Ниже дано краткое описание некоторых систем, а также ссылки на литературу,

ферментативной реакции) , пп

из которой можно составить представление об их точности и надежности.

Система API 20Е для идентификации Enterobacteria-сеае и несбраживающих бактерий (Analytab Products, Plainview, NY 11803) состоит из пластмассовой пластинки с 20 вставленными в нее микропробирками, содержащими (в сухом виде) различные среды, с помощью которых можно провести 23 биохимических теста в течение 18—24 ч. Среды становятся пригодными для использования при добавлении в микропробирки разбавленной суспензии испытуемых микроорганизмов. Суспензию предохраняют от высыхания, добавляя воду в углубления в пластмассовой пластинке, в которую помещают пробирки. В некоторые микропробирки добавляют стерильное вазелиновое масло для предотвращения доступа кислорода. Оценка надежности системы дается в работах [16, 31, 40, 68—70, 76, 78, 81].

Система API 20А для анаэробов (Analytab Products) похожа на систему API 20Е. Колонии бактерий суспендируют в среде для анаэробов и суспензию используют для разведения сухих сред в микропробирках в аэробных условиях. Затем пластинку с микропробирками помещают в анаэростат или анаэробный бокс и инкубируют от 24 до 48 ч при 35—37 °С [62].

Система Entero-Set 20 для идентификации Entero-bacteriaceae (Fischer Scientific Co., Diagnostics Div., Orangeburg, NY 10962) похожа на систему API. Их отличие состоит в том, что при заполнении микропробирок первой системы бактериальной суспензией из них удаляется воздух. В некоторые пробирки добавляют масло, чтобы предотвратить доступ кислорода к среде.

Система Minitek для Enterobacteriaceae, несбраживающих бактерий, Neisseria и анаэробов (BBL Microbiology Systems, Cockeysville, Md 21030) состоит из пластмассовой пластинки с 12 лунками. С помощью специального устройства в лунки помещают диски, импре-гнированные субстратами. Набор дисков подбирают фирма-изготовитель или те, кто ими пользуется. С помощью автоматической пипетки со стерильным наконечником одноразового пользования в каждую лунку помещают суспензию испытуемой бактерии в бульоне Minitek. Некоторые лунки покрывают слоем масла. Время инкубации для представителей сем. Enterobacteria-сеае составляет от 18 до 24 ч, для несбраживающих бактерий — от 24 до 48 ч и для Neisseria —4 ч. Испарение в процессе инкубации предотвращают с помощью пластмассового увлажнителя. В случае анаэробных организмов суспензию клеток в бульоне для анаэробов разливают в лунки с дисками и инкубируют в анаэрос-тате или анаэробном боксе в течение 48 ч [17, 40, 41, 49, 89].

Система PathoTec Rapid I-D для идентификации En-terobacteriaceae и других групп (General Diagnostics Div., Warner-Lambert Co., Morris Plains, NJ 07950) состоит из 10 полосок, пропитанных реактивами для тестов на фенилаланиндезаминазу, лизиндекарбоксилазу, утилизацию малоната и т. д. Полоски помещают в пробирки с суспензией испытуемых микроорганизмов; в некоторых случаях ими проводят по колониям клеток. Результат определяют приблизительно через 4 ч, за исключением теста на оксидазу, когда результат получают через 30 с [40, 68, 69].

Система Enterotube для идентификации представителей сем. Enterobacteriacea (Roche Diagnostics, Nutley, NJ 07110) состоит из пробирки с 8 отсеками, заполненными различными агаровыми средами. Через отсеки проходит канал с тонким металлическим стержнем. Выступающим концом стержня касаются колонии и затем протягивают его через все отсеки, засевая таким образом различные среды. Некоторые среды для защиты от воздуха покрывают слоем воска. Результаты учитывают после инкубации в течение 24 ч [39, 63, 68, 69, 92].

Система Oxi/Ferm для идентификации несбраживающих грамотрицательных палочек (Roche Diagnostics) похожа на систему Enterotube, но предназначена для несбраживающих организмов [31, 48, 71, 80].

Система Corning r/b Enteric Differential для идентификации представителей сем. Enterobacteriaceae (Corning Medical Microbiology Products, Roslyn, NY 11576) состоит из двух пробирок обычного размера с сужениями посередине, разделяющими их на 2 отсека