лючением некоторых видов Nocar-dia, но чрезвычайно устойчивы к высушиванию. У Лго-tobacter эти образования называют цистами, у Myxobac-teriales — микроцистами, термин же «циста» у последних относится к спорангию, содержащему микроцисты, если он имеется. У Nocardia сферические образования называют микроцистами или хламидоспорами. Методы окраски цист описаны в разд. 3.3,8.

20.1.19. Жгутики

Окрашивание жгутиков проводят для исследования с помощью светового (разд. 3.3.10) или электронного микроскопа (разд. 4.1.1 и 4.1.4). Во время окраски следует как можно меньше встряхивать бактерии, так как жгутики легко отрываются от клеток. При окрашивании жгутиков для световой микроскопии не исключены ошибочные результаты, так как у бактерий с полярно расположенными жгутиками пучок из нескольких жгутиков-может иногда выглядеть как один жгутик |[97]. Имеют значение и условия культивирования, например некоторые бактерии, такие, как Vibrio parahaemolyticus, прш росте на жидкой среде образуют один полярный жгутик, а при росте на твердой среде имеют еще и боковые, более короткие жгутики [82]. Некоторые бактерии,, например Listeria monocytogenes, не способны образовывать жгутики при высокой температуре, тогда как при пониженной они их имеют [50]. В некоторых случаях среды, содержащие глюкозу, могут подавлять образование жгутиков [15].

20.1.20. Флуоресцирующий пигмент

Делают один штрих на чашке со средой В-(разд. 20.3.5). Снимают крышки и проверяют чашки через 24, 48 и 72 ч под ультрафиолетовым светом. (<260 нм). Можно пользоваться коротковолновой лампой, применяемой для изучения образцов минералов. Чашки не следует продолжать инкубировать после просмотров, поскольку ультрафиолетовый свет оказывает бактерицидное действие. Положительная реакция: флуоресцирующая зона на агаре вокруг участков роста. Флуоресцирующие псевдомонады образуют желто-зеленый пигмент; некоторые виды Azotobacter, Azomonas и Beijerinckia могут образовывать зеленый или белый флуоресцирующий пигменты.

Примеры: положительный результат — Pseudomo-nas fluorescens; отрицательный — Escherichia coli.

20.1.21. Потребность в формиате и фумарате

Этот тест применяют для выявления некоторых анаэробов, которые окисляют формиат и попутно восстанавливают фумарат в сукцинат. Готовят основной фор-миатно-фумаратный раствор (Ф-Ф) (разд. 20.4.6) и добавляют 1 каплю раствора на 1 мл предварительно»

восстановленного пептонно-дрожжевого бульона PY (разд. 20.3.28) в момент его инокуляции в атмосфере очищенной от кислорода двуокиси углерода. Сравнивают рост на этой среде с ростом на среде без Ф-Ф. Положительная реакция: рост сильно стимулируется Ф-Ф. В некоторых случаях в отсутствие добавок вообще не наблюдается роста.

Примеры: положительный результат — Bacteroides corrolens; отрицательный — Bacteroides oralis.

20.1.22. р-Галактозидаза [56]

Бактерии культивируют в течение 18 ч гари 37 °С на скошенном агаре, содержащем три углевода и железо (разд. 20.3.34). Снимают выросшую культуру петлей с косяка и суспендируют в 0,25 мл физиологического раствора (0,85%-ный NaCl) до получения густой суспензии. Добавляют каплю толуола, встряхивают суспензию и инкубируют в течение 5 мин при 37 °С. Добавляют 0,25 мл диагностического реактива ОНФГ (разд. 20.4.13). Инкубируют в водяной бане при 37 °С и проверяют с интервалами до 24 ч. Следует также приготовить и инкубировать контрольную пробу без клеточной суспензии. Положительная реакция: появление желтой окраски.

Примеры: положительный результат — Escherichia coli; отрицательный — Proteus vulgaris.

20.1.23. Образование газов из Сахаров

Метод 1. Перед автоклавированием бульона с углеводами в пробирку помещают вверх дном стеклянный поплавок (^ 10X75 мм). После автоклавирования он полностью заполняется средой. В случае термолабильных Сахаров после автоклавирования и остывания к основной среде с соблюдением правил асептики добавляют их концентрированные растворы, стерилизованные фильтрованием. Пробирки оставляют приблизительно на день для диффузии Сахаров в перевернутые поплавки. Среду инокулируют и инкубируют. Положительный результат: накопление газа в поплавке. Примечание: если среду перед использованием хранят в холодильнике, а затем инокулируют и инкубируют, растворенные-газы в среде могут высвобождаться и накапливаться в поплавках, приводя к ложноположительной реакции. В качестве контроля используют стерильные пробы. Если клетки образуют очень небольшое количество двуокиси углерода, ее трудно обнаружить из-за высокой растворимости и быстрой диффузии в воздух. Такая проблема не возникает при применении методов 2 и 3.

Метод 2. Этот метод совпадает с методом 1 с той лишь разницей, что после инокуляции для предотвращения диффузии двуокиси углерода в воздух в пробирки добавляют — 1 мл стерильного минерального (вазелинового) масла.

Используют содержащую сахар агаровую среду, охлажденную после автоклавирования до 45°С (в случае термолабильных Сахаров к основной агаровой среде, расплавленной и охлажденной до 45 °С, добавляют концентрированный раствор сахара, стерилизованный фильтрованием). Пробирки инокулируют и позволяют агару затвердеть. Покрывают застывший слой приблизительно 6-мм слоем 2%-ного агара, не содержащего питательных веществ (т. е. агара, приготовленного на воде), а затем тонким слоем стерильного масла. Культуры инкубируют. Положительный результат: разрывы в среде и поднятие слоя агара.

Метод 3 [7]. Этот метод применяют только для анаэробов. Охлаждают расплавленный предварительно* восстановленный пептонно-дрожжевой агар PY (разд. 20.3.27), содержащий 1% глюкозы, до 45 °С и инокулируют столбик его 2—3 каплями культуры. Пробирки закрывают стерильной алюминиевой фольгой (не пробками), оставляют до затвердения среды и инкубируют. Положительный результат: образование пузырьков газа в среде или разрывов в агаре.

20.1.24. Гидролиз желатины

Метод 1. Используют 'бульон, содержащий 12% желатины.

(А) Пробы инкубируют при 20—22 °С 6 нед. Положительная реакция: разжижение по крайней мере части среды. При длительной инкубации следует предотвратить испарение среды. Примеры: положительный результат — Proteus vulgaris; отрицательный — Escherichia coll.

(Б) Если температура 22 °С слишком низка для роста, культуру инкубируют при оптимальной температуре роста, а затем охлаждают в холодильнике вместе с не-инокулированной контрольной пробой. Если среда не затвердевает, то это свидетельствует о гидролизе желатины; если же она затвердевает, то ее переносят вместе с контрольной пробой в помещение с комнатной температурой или в термостат с температурой 30 °С и инкубируют в наклонном положении около 30 мин. Когда среда в опытной пробе разжижается раньше, чем в контрольной, этот результат расценивается как слабая положительная реакция.

(В) Так же, как в методе Б, но с 4% желатины. Этот метод более чувствителен, чем метод Б.

Метод 2. Этот метод более чувствителен, чем методы 1А или 1Б. Агаровую среду в чашках, содержащую 0,4% желатины, инокулируют штрихом. Инкубируют при оптимальной для роста данного организма температуре. Заливают чашки реактивом, осаждающим желатину [15% HgCl2 в 20%-ной (по объему) конц. НС1]. Положительная реакция: зоны просветления вокруг колоний.

Метод 3. Это чувствительный метод, дающий возможность быстро получить результат. Бактерии выращивают в пробирке с бульоном, содержащим диски с активированным углем и желатиной (разд. 20.4.3). Положительная реакция: освободившиеся частицы активированного угля могут распределяться по всему объему среды.

20.1.25. Окраска по Граму

Методика окраски по Граму описана в разд. 3.3.5.

20.1.26. Гемолиз

Метод 1. Кровяной агар в чашке засевают штрихом (разд. 20.3.7). Инкубируют при 37 °С 24—48 ч. В результате ^-гемолиза вокруг колоний образуются прозрачные бесцветные зоны. Эритроциты в этих зонах полностью лизируются. В результате а-гемолиза образуется нечеткая зона частично разрушенных эритроцитов, часто с появлением зеленовато-коричневой окраски среды. В результате а'-гемолиза непосредственно вокруг колоний образуется небольшой ореол из целых или частично лизированных эритроцитов, а к нему примыкает зона полного гемолиза, распространяющаяся далее в среду. При визуальном просмотре а'-гемолиз можно спутать с р-гемолизом. Примечание: некоторые бактерии, например определенные стафилококки, осуществляют р-гемо-лиз только в том случае, если чашки с инокулирован-ной средой предварительно инкубируют 48 ч при 37°СГ а затем охлаждают в холодильнике в течение 1 ч (горя-че-холодный гемолиз).

Метод 2. Чашку с основой кровяного агара (без добавления крови) инокулируют штрихом. Засеянную среду заливают 10 мл кровяного агара (при 45—50 °С). В данном случае а- или р-гемолиз может быть более четко выражен, чем в методе 1, поскольку колонии погружены в агар и это обеспечивает некоторую защиту гемолитических ферментов (гемолизинов), способных инактивироваться под действием кислорода.

20.1.27. Гидролиз гиппурата

Метод 1. Готовят бульонную среду с добавлением 1,0% гиппурата натрия. После автоклавирования отмечают уровень среды в каждой пробирке. Среду инокулируют и инкубируют 4 дня параллельно со стерильной контрольной пробой. Если среда частично испаряется, в конце инкубационного периода добавляют дистиллированную воду до первоначального уровня. В небольшую пробирку вносят 1,0 мл стерильного контрольного бульона и добавляют порциями по 0,10 мл раствор хлорида железа(Ш) (12 г FeCl3-6H20 в 100 мл 2%-ной НС1). После каждой добавки пробирку встряхивают. Сначала выпадает осадок гиппурата железа, который после дальнейших добавок хлорида железа(III) растворяется с образованием прозрачного раствора. Определяют наименьшее общее количество хлорида железа (III), которое приводит к растворению осадка. Исследуемую бульонную культуру центрифугируют, переливают 1,0 мл надосадочной жидкости в другую пробирку и добавляют к нему раствор хлорида железа(III) в объеме, эквивалентном количеству, определенному ра-лее для контроля. Положительная реакция: образование плотного устойчивого осадка бензоата жел