Биологический каталог




Методы общей бактериологии. Том 3

Автор Ф.Герхардт

г желатины и дистиллированная вода объемом до 1 л.

Еще лучшими свойствами обладает раствор, применяемый для разведения в общих целях, который имеет состав: 0,4 М NaCI (или 0,5 М сахарозу) для создания осмотического равновесия, 50 мМ фосфатный буфер с рН ростовой среды (разд. 6.1.2), 50 мМ MgS04 для сохранения целостности мембран и 0,01 % желатины в качестве стабилизирующего фактора (последняя может быть исключена, если почему-либо не подходит для работы с данными клетками). Этот раствор особенно хорош для грамотрицательных бактерий, которые легче повреждаются, чем грамположительные. Другие соображения по поводу растворов для разведения, применяемых при отмывке бактерий, приводятся в разд. 10.4.2 и 19.1.1.

В критических и необычных случаях раствор следует подбирать специально. Если нужно задержать рост клеток, в качестве лучшего раствора для разведения может послужить питательная среда без источников углерода. При использовании солевого буфера с желатиной, как правило, требуется корректировка рН и осмотического давления. Для многих анаэробных бактерий раствор для разведения должен содержать какой-нибудь восстановитель и в нем не должно быть растворенного кислорода (разд. 6.6.3 и 6.6.4). При работе с микроорганизмами могут возникать проблемы, связанные с адсорбцией бактериальных клеток на поверхности стеклянной посуды (см. Введение к гл. 11). Трудности могут появиться и при электроподсчете клеток (разд. 11.1.2), а также в других случаях, когда, например, клетки не расходятся после деления или агрегируют благодаря адгезивным свойствам поверхности или за счет электростатического заряда. Такие группы клеток иногда можно диспергировать путем физических воздействий— очень кратковременной обработкой ультразвуком или интенсивным перемешиванием в миксере типа Vortex. При этом подсчитывают число жизнеспособных клеток и с помощью микроскопа следят за тем, чтобы диспергирование клеток было максимальным, а разрушение минимальным. Диспергированное состояние клеток поддерживают, а иногда его достигают, добавляя к раствору для разведения химический агент, который адсорбируется клетками и придает им отрицательный заряд, обусловливающий отталкивание. В качестве таких агентов рекомендуется добавлять детергенты (разд. 10.3.3), например 0,1% твина 80; однако эти вещества эффективны в основном для ми-кобактерий или клеток с гидрофобной поверхностью и могут оказаться вредными для других клеток. Эффективными диспергирующими агентами, подходящими для обычно используемых в экспериментах бактерий, являются полимеризованные органические соли сульфоно-вых кислот алкил-арильного типа (соединения ряда лигнина) [5].

Растворы для разведения более подробно рассматриваются в работе Мейнеллов [6], а выживанию вегетативных форм микробов посвящен целый симпозиум [3].

25.2. ИЗМЕРЕНИЕ БИОМАССЫ

На измерении массы бактериальной клетки часто основываются измерения активности обмена веществ, а также изучение морфологических и химических особенностей компонентов клетки. Число клеток и биомасса— два самых существенных параметра бактериального роста, в то время как удельный вес — важная характеристика самой клетки.

Методы измерения биомассы представляются очевидными и прямыми. На деле же, если требуется высокая точность, они достаточно сложны. Результаты при этом могут быть выражены разными способами, а полученные величины являются скорее относительными, чем абсолютными. Об этом нельзя забывать при их определении.

25.2.1. Сырой вес

Номинальный (полный) вес сырых бактериальных клеток (сырой вес) из жидкой суспензии определяют взвешиванием образца в таре с известным весом после отделения и отмывки клеток фильтрованием или центрифугированием. Однако и в том и в другом случае в интерстициальное (межклеточное) пространство захватывается раствор для разведения, вес которого входит в величину сырого веса биомассы, причем количество интерстициального раствора может быть существенным. В объеме, плотно заполненном жесткими сферами, на пространство между сферами приходится 27% общего объема. Для плотно упакованных бактериальных клеток интерстициальное пространство может составить от 5 до 30% в зависимости от их формы и степени деформации.

По одному из способов получения истинного сырого веса самих клеток из номинального сырого веса вычитают вес раствора, находящегося в межклеточном пространстве. Последний определяют экспериментальным путем, как описано в разд. 19.1.2. Согласно другому способу, для которого требуется специальное оборудование, клетки частично подсушивают и затем предоставляют им возможность перейти в равновесное состояние и набрать постоянный сырой вес в замкнутой камере для взвешивания, в которой поддерживается 100%-ная относительная влажность при постоянной температуре.

25.2.2. Сухой вес

Номинальный вес сухих бактериальных клеток (сухой вес), находящихся в жидкой суспензии, определяют после высушивания пробы в сушильном шкафу при 105 СС до постоянного веса. Клетки должны быть промыты водой, в противном случае следует ввести поправку на компоненты среды или раствора для взвешивания, которые остаются в клетках при высушивании. Отделение клеток с помощью фильтрования осложняется некоторыми трудностями (разд. 10.5). Ряд проблем возникает при их высушивании в сушильном шкафу; при этом например, могут теряться летучие компоненты клеток или может происходить некоторая деградация компонентов клетки, что хорошо заметно по обесцвечиванию (особенно при использовании высоких температур). При переносе проб и взвешивании в комнатной атмосфере может происходить некоторое обратное поступление влаги. Поэтому все операции следует проводить быстро, в течение одного и того же времени для параллельных проб. Лучше всего, конечно, использовать сосуды для взвешивания с известным весом, которые после высушивания можно запечатать.

Наиболее точные измерения производят путем высушивания проб до постоянного веса в эксикаторе, содержащем пятиокись фосфора (Р2О5), при 80° С под вакуумом или лиофилизацией (разд. 12.2.1). Наш опыт свидетельствует о том, что результаты, получаемые этими тремя методами, не различаются в пределах 1% [2]. Превосходное обсуждение методик определения сухого веса и возможных ошибок дает Мэллит [4].

Сухой вес можно привести к единице сырого веса (граммы твердого вещества на 1 г биомассы клеток) или к единице сырого объема (граммы твердого вещества на 1 см3 биомассы клеток или на 1 см3 клеточной суспензии).

25.2.3. Содержание воды

Количество клеточной воды в полностью гидратяро-ванных клетках равно разности между сырым весом (разд. 25.2.1) и сухим весом (разд. 25.2.2) этих клеток

Содержание воды можно также рассчитать с учетом влажности атмосферы или активности воды в растворе, где находятся клетки (разд. 6.2). Полностью высушенные клетки приходят в равновесие с атмосферой, влажность которой известна и контролируется, насыщаясь водой с постепенно возрастающей скоростью [7]. Этот процесс описывается типичной изотермой сорбции, представленной на рис. 25.1. Начальная фаза сорбции воды, происходящей при очень низких значениях влажности, соответствует прочному связыванию воды, поглощаемой в виде монослоя; фаза промежуточного плато соответствует непрочному связыванию воды, поглощаемой в виде множества слоев; конечная фаза, имеющая место при высоких значениях влажности, отражает поглощение большей части раствора — так называемой свободной воды. Общее количество воды в полностью

гидратированных клетках получают при 100%-ной влажности. Однако точное измерение этого количества затруднено в связи с крутым наклоном изотермы сорбции.

Оценивать количество клеточной воды иногда удобно, измеряя количество проникших в клетки D2O, 14С-мочевины или ^-глицерина (разд. 19.1.5) с учетом поправки на межклеточное пространство.

Количество клеточной воды можно привести к единице сырого веса (граммы воды на 1 г сырого веса), к единице сухого веса (граммы воды на 1 г обезвожен50 '00

Относительная блажност, % ных клеток) или к единице

ды на ток), всего ние к

хотя наиболее фундаментальным

сырого объема (граммы во-1 см3 биомассы кле-Бактериологи чаще используют приведе-единице сырого веса, является приведение

к единице сухого веса. Переход от содержания воды по отношению к сухому весу (СВсух) к содержанию воды по отношению к сырому весу (СВсыр) выражается уравнением: СВсух ~СВ сыр/(1—СВСЫР). К примеру, 400% сух = 80% сыр.

25.2.4. Объем

Объем биомассы клеток (или средний размер отдельной клетки) лучше всего определяется по методике, описанной в разд. 19.1.

25.2.5. Плотность сырого и сухого вещества

Плотность вещества бактериальной клетки (собственно удельный вес) определяют либо как плотность сырого вещества, рассчитываемую на полное содержание твердых и жидких компонентов, либо как плотность сухого вещества («химическая плотность»), рассчитываемую на содержание только твердых компонентов. Обе величины выражаются в единицах веса, приходящихся на единицу объема (граммы на 1 см3).

Плотность сырого вещества получают простым делением сырого веса клеток (разд. 25.2.1) на занимаемый ими объем (разд. 25.2.4).

Сходным образом можно вычислить плотность сухого вещества, поделив сухой вес клеток (разд. 25.2.2) на занимаемый сухими клетками объем. К сожалению, этот объем трудно определить точно. Сначала клетки полностью высушивают, например лиофилизацией (разд. 12.2.1). Чтобы удалить поглощенный газ и остаточные пары воды, довольно большие количества (больше 2 г) высушенных клеток выдерживают в условиях высокого вакуума до тех пор, пока давление не выйдет на постоянный уровень при значениях меньше, например, чем 0,01 мкм рт. ст. (— 1,33 мПа). Затем с помощью адсорбционного волюметра измеряют объем инертного или непоглощающегося клетками газа (например, гелия или азота), который выходит из них. Этот метод был испытан Берлином и др. [1] на бактериальных спорах. Соответствующее оборудование имеется в продаже (Fekrumeter; Gallard-Schlesinger, Inc., Carle Place, NY 11514).

Плотность сухого и сырого вещества оценивают с помощью равновесного цен

страница 39
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45

Скачать книгу "Методы общей бактериологии. Том 3" (2.64Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(15.11.2019)