Биологический каталог




Методы общей бактериологии. Том 3

Автор Ф.Герхардт

рки отбирают по 100 мкл препарата для определения степени реассоциации с помощью гидроксилаиатита или нуклеазы S1 (см. ниже).

Методика с гидроксилапатитом

Эта методика дает возможность путем избирательной адсорбции на гидроксилапатите (Bio-Rad Laboratories, Richmond, Calif.) отделять двухцепочечную ДНК от одноцепочечной. Двухцепочечная ДНК адсорбируется на гидроксилапатите в 0,14 М фосфатном буфере, в то время как одноцепочечная не адсорбируется [11]. Различные партии гидроксилапатита отличаются по адсорбционной емкости, поэтому иногда требуется испытать не одну партию.

1. 0,5 г гидроксилапатита вносят в пробирку (13Х ХЮО мм), добавляют 3,0 мл 0,14 М фосфатного буфера (эквимолярные количества NaH2P04 и Na2HP04), содержащего 0,4% ДСН; гидроксилапатит суспендируют с помощью встряхивателя Vortex и нагревают пробирку при 60 °С в водяной бане.

2. Добавляют 100 мкл реакционной смеси, перемешивают во встряхивателе Vortex и снова ставят в водяную баню.

3. Пробирку центрифугируют 3—4 мин при 5000 об/мин, сливают буфер в пробирку размером 18X150 мм и добавляют к гидроксилапатиту еще 3 мл 0,14 М фосфатного буфера. Вновь нагревают, перемешивают, центрифугируют и сливают надосадочную жидкость в пробирку, в которой находится первый центри-фугат.

4. Добавляют к гидроксилапатиту 3 мл 0,28 М фосфатного буфера, перемешивают и центрифугируют. Декантируют надосадочную жидкость во вторую пробирку. К гидроксилапатиту добавляют еще 3 мл буфера, перемешивают, центрифугируют и надосадочную жидкость сливают в ту же пробирку.

5. В каждую пробирку добавляют 30 мкг ДНК-носителя (50 мкл ДНК из спермы лосося в концентрации 0,6 мг/мл) и перемешивают. Добавляют ТХУ до конечной концентрации 5% и еще раз хорошо перемешивают с помощью встряхивателя Vortex. Охлаждают в холодильнике в течение 1 ч.

6. Осадки собирают на нитроцеллюлозных фильтрах, фильтры высушивают, помещают в сцинтилляционные флаконы и измеряют радиоактивность.

7. Сумма импульсов в двух сцинтилляционных флаконах представляет собой общее количество импульсов в минуту в реакционном сосуде. Число импульсов в минуту в первом сцинтилляционном флаконе соответствует количеству импульсов в минуту нереассоциированной ДНК, а во втором — реассоциированной ДНКСтепень гомологии определяют, разделив значение радиоактивности, полученное при гетерологичной реассоциации, на величину радиоактивности, полученной при гомологичной реассоциации, и умножив результат на 100. В табл. 22.2 приводится пример подобных расчетов.

Бреннер и др. [11] описали эффективную методику, по которой на гидроксилапатите фракционируют большие количества ДНК.

Методика с нуклеазой S1

При тщательно контролируемых условиях нуклеаза S1 гидролизует одноцепочечную ДНК и оказывает слабое действие на двухцепочечную ДНК [17]. Следовательно, степень комплементарности между фрагментами меченой ДНК и избытком фрагментов немеченой ДНК можно определить, измерив количество ДНК, устойчивой к нуклеазе S1 (т. е. осаждаемой ТХУ), по радиоактивности.

1. 100 мкл образца из каждой пробирки с реакционной смесью вносят в полипропиленовую пробирку (12Х Х75 мм), содержащую 1 мл буферного раствора 0,05 М ацетат натрия +0,3 М NaCl + 0,5 мМ ZnCI2, рН 4,6, и 50 мкл денатурированной фракционированной ДНК из спермы лосося с концентрацией 0,5 мг/мл. Содержимое пробирки перемешивают с помощью встряхивателя Vortex и затем добавляют к нему 50 мкл нуклеазы S1. Смесь вновь перемешивают и инкубируют в водяной бане при 50 °С в течение 1 ч.

2. Пробирки вынимают из водяной бани, добавляют равные объемы 10%-ной ТХУ, хорошо перемешивают с помощью встряхивателя Vortex и охлаждают в холодильнике в течение 1 ч.

3. Осадок собирают на нитроцеллюлозном фильтре, фильтр сушат, помещают в сцинтилляционный флакон и измеряют радиоактивность. При этом выявляются только фрагменты ДНК, устойчивые к нуклеазе S1.

Методика с нуклеазой S1

Сосуд с реакционной смесью Радиоактивность ДНК, устойчивой к нуклеазе S1, имп/мин Радиоактив ность ДНК. устойчивой к иуклеазе SL чистые имп/мин Степень гомологии, %

Только фрагменты меченой 100

ДНК 100

Гомологичная реассоциация 900 800

Гетерологичная реассоциа- 600 500 62

ция

Степень гомологии определяют, разделив число импульсов в минуту гетерологичной устойчивой к нуклеазе S1 ДНК на число импульсов в минуту гомологичной устойчивой к нуклеазе S1 ДНК и умножив результат на 100. Пример подобных расчетов приведен в табл. 22.2.

Методика, основанная на сравнении термостабильности

Степень некомплементарности пар азотистых оснований можно определить, сравнивая термостабильность гетерологичных двухцепочечных комплексов с термостабильностью гомологичных двухцепочечных комплексов. Уменьшение количества меченой устойчивой к нуклеазе S1 ДНК определяют в процессе постепенного нагревания реассоциированной ДНК в водяной бане вплоть до температуры денатурации. Реассоциацию проводят обычным способом, используя, однако, при этом большие объемы реакционных смесей. Ниже представлен состав реакционных смесей, которые готовят в пробирках размером 13X100 мм с завинчивающимися крышками.

Меченая ДНК 0,12 мл

Немеченая ДНК 0,60 мл

Буферный раствор 0,88 М NaCl+10"3 М HEPES 0,60 мл

Общий объем 1,32 мл

1. Пробирки инкубируют в течение 20—24 ч при температуре на 25 °С ниже Тт меченой ДНК (определенной в буфере SSC).

2. Пробирки охлаждают до комнатной температуры и добавляют 1,32 мл 50%-ного (по объему) раствора формамида в дистиллированной воде.

3. Пробирки помещают в циркулирующую водяную баню, уровень воды в которой должен быть чуть ниже крышек пробирок во избежание изменения концентрации компонентов в пробирках за счет испарения и конденсации жидкости на стенках пробирок.

4. Определение термостабильности начинают при 45°С и выдерживают пробирки при этой температуре в течение 5 мин. Затем отбирают пробу 200 мкл, вносят ее в пробирку, содержащую 1,0 мл буферного раствора ацетат + NaCl + ZnCl2, рН 4,6 (см. выше методику с гидроксилапатитом), и вновь помещают пробирку с реакционной смесью в водяную баню. Отбирают пробу стандартной пипеткой или микропипеткой с положительным вытеснением (другие микропипетки не обеспечивают точных результатов из-за колебаний температуры).

5. Температуру водяной бани повышают на 5°С ив течение 5 мин ждут, пока она установится. Еще через 5 мин отбирают следующую пробу. Продолжают таким образом до 90°С—всего отбирают 10 проб.

В пробы вносят нуклеазу S1 (см. методику с нукле-азой S1). Число импульсов в минуту устойчивой к нуклеазе S1 ДНК откладывают против температуры. Температуру, при которой 50% двухцепочечных комплексов становятся чувствительными к нуклеазе S1

(т. е. диссоциируют), обозначают Tm(t) (необратимое разделение цепей, индекс i от англ. irreversible — необратимый). Разницу между Тт^ для гомологичных и гетерологичных цепей обозначают ДГтт- Количество ошибочно связанных пар азотистых оснований, приходящихся на каждый градус Цельсия АТтц), варьирует от 1 до 2,2%Определение значений C0t

Начальная реассоциация цепей ДНК в растворе происходит по типу кинетики второго порядка II, б, 12, 19, 59]. Скорость реассоциации является функцией величины генома; ее используют для определения его размера. Обычно уравнение реакции 2-го порядка [уравнение (1)] можно преобразовать [уравнение (2)] для получения так называемых кривых Cot [12].

1/С—1/С0=&, (1)

C/C0=l/(\+kC0t), (2)

где С — концентрация одноцепочечной ДНК в момент времени t в молях нуклеотидов на 1 л; С0 — концентрация одноцепочечной ДНК в нулевой момент времени в молях нуклеотидов на 1 л; t — время в секундах, а к — константа скорости реассоциации.

Количество молей нуклеотидов на 1 л равно частному от деления количества ДНК в мг/мл на 331 мг ДНК на ммоль нуклеотидов. Единица ммоль/мл равна моль/л (М). Уравнение (2) соответствует гиперболической кривой, описываемой общей формулой

у=1(\+ах). (3)

Если в уравнении (3) #=72, то x*=l/a = xi/it a a~\/xi/2. При откладывании на графике логарифмов значений х при у'=72 получаем lg а = lg \/xi/9 ——lg*i/2- В общем виде логарифмическая кривая для \gC0t представлена на рис. 22.9. Участок кривой, соответствующий изменению абсциссы приблизительно на два логарифма, является почти линейным. Это объясняется тем, что любое существенное изменение величины С/С0 происходит в интервале от 1/(1+0,1) до 1/(1 +10), т. е. при значении

kC0ty варьирующем от 0,1 до 10. Константа скорости ?—1/Cofi/,, а ее размерность моль"1?"1.

Денатурированная ДНК в растворе может реассо-циировать при значениях kC0t намного выше 10, поэтому значение точного времени инкубации или точных концентраций фрагментов ДНК определять не обязательно. Однако при определении значений C0ti/2 эти параметры необходимы, так как в этом случае определяют ряд точек между kCQt=0,\ и kC0t=\0. На практике значения C0t для бактериальных ДНК варьируют приблизительно от 0,1 до 50. Изменяя время инкубации и концентрацию немеченой ДНК или и то и другое вместе, можно получить отдельные значения C0t, В табл. 22.3 приведены значения Cot для четырех различных концентраций ДНК и восьми различных времен инкубации.

Набор смесей для реассоциации готовят обычным способом (разд. 22.6.4 «Предварительные процедуры»)1 по две пробирки для каждой концентрации ДНК и каждой температуры. После завершения инкубации одной серии смесей пробирки помещают в морозильник до окончания инкубации всех остальных серий. Степень образования двухцепочечных комплексов определяют с помощью гидроксилапатита или нуклеазы S1 (разд. 22.6.4).

Долю фрагментов ДНК, несорбирующихся гидроксил-апатитом или чувствительных к нуклеазе S1, откладывают по оси г/, а значения C0t — по оси х в логарифмическом масштабе.

Если количество двухцепочечных комплексов измеряют с помощью гидроксилапатита, то константу скорости к вычисляют по уравнению (2). Однако результаты, полученные по методике с нуклеазой S1, не отражают кинетику 2-го порядка, поскольку при этом гидролизуются концы двухцепочечных фрагментов. Отношение между этими двумя процедурами можно представить с

страница 25
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45

Скачать книгу "Методы общей бактериологии. Том 3" (2.64Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(27.06.2022)