, при температуре — 20°С или ниже.

Суммарная РНК, выделенная по описанной выше методике, обычно используется в качестве конкурента в экспериментах по конкуренции (разд. 22.7.3); при желании ее можно расфракционировать на компоненты. Препараты радиоактивной РНК обычно фракционируют (разд. 22.7.1) и компоненты используют в опытах по гибридизации.

22.4. КОНЦЕНТРАЦИЯ И СТЕПЕНЬ ЧИСТОТЫ

НУКЛЕИНОВЫХ кислот

22.4.1. УФ-спектрофотометрия

Наиболее распространенный метод определения концентрации нуклеиновых кислот в растворах при комнатной температуре состоит в измерении оптической плотности (поглощения) при 260 нм. При использовании кювет толщиной 1 см величину оптической плотности определяют по следующим формулам [5, 59].

Для нативной (двухцепочечной) ДНК:

Оптическая плотность при 260 нм

мг/мл =

Для РНК или денатурированной (одноцепочечной) ДНК:

Оптическая плотность при 260 нм

20

23

мг/мл

На практике концентрация ДНК в большинстве исходных препаратов варьирует от 0,5 до 2 мг/мл. Удобнее всего делать разведение 1 : 20 (0,1 мл раствора ДНК добавляют к 1,9 мл буфера). При этом величина поглощения не превышает пределов измерения большинства спектрофотометров и ее определяют прямо в миллиграммах ДНК на 1 мл исходного препарата.

Метод УФ-спектрофотометрии используют также для обнаружения примесей. 1) Белки сильно поглощают свет при 280 нм. Показателем загрязнения исследуемого раствора белком служит отношение величины оптической плотности раствора нуклеиновой кислоты при 260 нм к ее величине при 280 нм (А260/А280). Однако коэффициент экстинкщш белка очень низок по сравнению с коэффициентом экстинкции нуклеиновых кислот, и, следовательно, отношение А260/А280 нельзя считать

очень чувствительным показателем присутствия примесей. 2) Спектр поглощения нуклеиновых кислот имеет максимумы приблизительно при 208 и 260 нм, а минимум — при 234 нм. Пик при 208 нм не специфичен для нуклеиновых кислот, так как при этой длине волны поглощают свет многие соединения. Если в препарате нуклеиновой кислоты содержится примесь, поглощающая при 208 нм, то оптическая плотность в минимуме спектра нуклеиновой кислоты будет завышена. Таким образом, отношение А234/А260 — довольно чувствительный показатель присутствия примеси в препарате ДНК. 3) Максимум поглощения фенола расположен при 270 нм. Отсюда следует, что отношение А270/А260 — достаточно чувствительный показатель загрязнения препарата нуклеиновой кислоты фенолом.

22.4.2. Гиперхромизм

Основной примесью в препаратах ДНК обычно является РНК- Эти две нуклеиновые кислоты невозможно дифференцировать непосредственно по их поглощению в УФ-области. Определение фракции препарата, соответствующей ДНК, можно провести с помощью измерения гиперхромизма, наблюдаемого при тепловой денатурации ДНК (разд. 22.5). При этом поглощение препарата чистой нативной ДНК при 260 нм возрастает приблизительно на 40%. Если вторичная структура примесной РНК разрушается РНКазой, то для РНК гиперхромизма не наблюдается, но если вторичная структура РНК не нарушается, то величина гиперхромизма для нес составляет приблизительно 30%. Плавление РНК происходит при более низкой температуре и в более широком температурном интервале, чем в случае ДНК, поэтому кривые плавления для РНК и ДНК легко различаются. Для определения процентного содержания ДНК в препарате необходимо разделить величину гиперхромизма, связанного с ДНК, на 0,4 и умножить на 100.

22.4.3. Определение концентрации ДНК в реакции с дифениламином

Реакция с дифениламином специфична для дезокси-рибозы в ДНК- Хотя наиболее распространенной ярля,ется методика Бертона (разд. 17.5.1), ниже мы приводим методику в модификации Жиля и Мейерса [27], для которой характерна высокая чувствительность.

1. 1 мл раствора ДНК помещают в пробирку (1бХ Х125 мм) с завинчивающейся крышкой и добавляют к нему 1,0 мл 20%-ной (вес/объем) хлорной кислоты.

2. Добавляют 2,0 мл ледяной уксусной кислоты, содержащей 4% (вес/объем) дифениламина.

3. Добавляют 0,2 мл 0,16%-ного (вес/объем) раствора ацетальдегида.

4. Пробу перемешивают и инкубируют в течение ночи при 30 °С.

5. Определяют оптическую плотность при 595 и 700 нм и вычисляют разницу. Сравнивают ее с величинами, полученными для стандартов, содержащих известные количества чистой стандартной ДНК (ДНК тимуса теленка или спермы лосося; Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.), и определяют концентрацию ДНК в пробе. Эта методика хороша для растворов очищенной ДНК с концентрацией от 5 до 50 мкг/мл.

Ее можно применять в ходе изучения гомологии ДНК при количественных определениях ДНК, связанной с нитроцеллюлозными мембранами. Она особенно полезна в экспериментах по гомологии рРНК, когда необходимо узнать количество ДНК, присутствующей на мембране в конце гибридизации. После измерения радиоактивности мембраны удаляют из сцинтилляционной жидкости (используют смесь на основе толуола для того, чтобы мембраны не растворялись и радиоактивность не вымывалась) и сушат на воздухе. Затем мембраны помещают в 10%-ную хлорную кислоту (2 мл) и нагревают в кипящей водяной бане в течение 5 мин. После охлаждения проб до комнатной температуры осуществляют описанный выше этап 2.

22.4.4. Определение РНК в реакции с орцином

Орцин применяется для определения концентраций РНК, хотя в ограниченной степени он реагирует и с ДНК Подробно эта методика описана в разд. 17.5.2.

№

?2 ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА

22.5. СОСТАВ ОСНОВАНИЙ ДНК

Существует несколько методов определения молярных процентов гуанина и цитозина (мол. % G + C) в ДНК, которые мы перечислим ниже: 1) гидролиз и последующее разделение нуклеотидов или пуриновых или пиримидиновых оснований; 2) определение плавучей плотности; 3) определение температуры плавления (денатурации); 4) бромирование [58]; 5) апуринизация [37]; 6) определение отношения А2бо/А-28о в буфере с низкой ионной силой при рН 3 [25]; 7) жидкостная хроматография под высоким давлением нуклеотидов или свободных оснований [14,39]. Примесь РНК мешает определению всеми этими методами, за исключением методов, основанных на измерении плавучей плотности и температуры плавления (Тт), поэтому последние стали наиболее популярными.

22.5.1. Метод, основанный на измерении плавучей плотности

Этот метод включает аналитическое ультрацентрифугирование, описание которого выходит за рамки данной главы. Он описан Манделем и сотр. [42].

22.5.2. Метод, основанный на анализе кривых плавления

Впервые корреляция между температурой плавления (Тт) и составом оснований ДНК была описана Марму-ром и Доти [45]. Мандель и др. [41] и ДеЛей [18] повторно исследовали эту корреляцию и также пришли к выводу о наличии связи между значениями Тт и плавучей плотности. Феррагут и Леклерк [23] сравнили методы определения Тт по кривым плавления. На значение Тт сильно влияет ионная сила используемого буфера, причем это характерно для всех препаратов ДНК. Следовательно, необходимо либо знать ионную силу применяемого буфера, либо использовать стандартный препарат ДНК, имеющий ту же ионную силу, что и неизвестные образцы. Последнее легко сделать: следует просто диализовать все препараты ДНК (включая стандартную ДНК) в одной и той же партии буфера.

Методика

Эта методика достаточно надежна, ее можно использовать не только с приведенными ниже, но и с другими буферами.

1. Готовят 2—4 л буфера 0,5X SSC (разд. 22.2.1), рН 7,0. Часть буфера оставляют для разбавления препаратов ДНК и для промывания кювет непосредственно перед тем, как вносят в них образцы ДНК. Оставшееся количество делят на 2 равные части так, чтобы во время диализа можно было один раз сменить буфер (см. этап 3).

2. Готовят пробы ДНК по 2—5 мл (в зависимости от размера используемых кювет) с концентрацией 50 мкг/мл, применяя для разбавления исходных препаратов ДНК буфер 0,5 X SSC. Готовят 10—20 мл раствора ДНК-стандарта (например, известно, что содержание G-f-C в ДНК E.coli b равно 51 мол.%, а температура плавления Тт в буфере SSC 90,5 °С), поскольку ее необходимо провести через все стадии анализа.

3. Диализуют одновременно все препараты в течение

Температура

Абсорбция, ~~ проба 1

Рис. 22.3. Кривые плавления для двух образцов ДНК, полученные с помощью регистрирующего спектрофотометра. Точки пересечения любой вертикальной линии с кривыми поглощения и температуры представляют собой значения этих параметров в данное время. Точки перегиба на кривых плавления соответствуют температурам плавления (Тш).

Адсорбция, проба 2

ночи в буфере 0,5XSSC. После первых нескольких часов диализа буфер заменяют. По окончании диализа препараты ДНК снова переносят в пробирки с завинчивающимися крышками.

4. Определяют кривую плавления с помощью регистрирующего спектрофотометра с термостатируемой ячейкой для кювет, в которую вмонтирована термопара.

5. Определяют значения Тт, как показано на рис. 22.3.

6. Вычисляют молярные проценты G + C в образце ДНК с помощью уравнения [26]:

мол. % (G+Qx =

= мол. % (G+QCT + l,99(Tm(x)~rm(CT)),

где мол.% (G + C)CT — известные мол.% (G + C) стандартной ДНК, а Тт(Х) и Тт(ст) — значения Тт для изучаемого образца ДНК и стандартной ДНК соответственно.

22.6. ГОМОЛОГИЯ ДНК

Для определения сходства последовательностей нук-леотидов в цепях ДНК (или РНК) у различных организмов изучают гомологию и термостабильность ДНК (РНК). При изучении гомологии можно измерить долю геномов (или долю специфических генов, таких, как гены рРНК), которые при определенной ионной силе и температуре способны образовывать двухцепочечные комплексы. Изучение термостабильности позволяет определить степень ошибочного образования пар оснований в гетеродуплексах (гибридах).

Существует два общих метода изучения гомологии. Первый из них, который часто называют мембранным методом, заключается в следующем. Сначала иммобилизуют денатурированную (одноцепочечную) немеченую ДНК на нитроцеллюлозном фильтре, на котором добавляемая двухцепочечная ДНК не адсорбируется. Затем этот фильтр инкубируют в присутствии фрагментов радиоактивной денатурированной ДНК (или РНК, если изучается гомо