Биологический каталог




Методы общей бактериологии. Том 3

Автор Ф.Герхардт

бавляют РНКазу (50 мкг/мл) и инкубируют 30 мин при 37 °С.

10. В раствор ДНК добавляют 5—10 мл смеси хлороформ— изопентанол и встряхивают 15 мин на качалке, как описано в п. 3. Эмульсию центрифугируют (см. п. 4) и надосадочную жидкость сливают (см. п. 5). Экстракцию смесью хлороформа и изопентанола повторяют до тех пор, пока после центрифугирования на поверхности раздела фаз почти не останется белка.

11. ДНК осаждают этанолом, наматывая на палочку, и растворяют в буфере 0,1 X SSC. Процедуру повторяют 2—3 раза для удаления рибонуклеотидов. Каждый раз перед осаждением этанолом концентрацию буфера SSC доводят до IX.

12. Наконец, растворяют ДНК в буфере 0,1 X SSC и хранят в морозильнике при —20°С или, добавив в пробирку 2—3 капли хлороформа, в холодильнике.

22.2.2. Метод адсорбции ДНК на гидроксилапатите

Первыми выделили ДНК методом адсорбции на гидроксилапатите Бриттен и др. [13]. С тех пор появились описания нескольких модификаций этого метода [32, 35, 43, 47]. Ниже приводится один из наиболее удачных вариантов.

Реактивы

Солевой буфер с ЭДТА (разд. 22.2,1); 20°/о-ный (вес/объем) раствор ДСН (разд. 22.2.1.); РНКаза (разд. 22.2.1); жидкий фенол, хроматографически чистый, насыщенный водой; гидроксилапатит; предназначенный для фракционирования ДНК биогель НТР (Bio-Rad Laboratories, Richmond, Calif.); 1,0 M фосфатный буфер, рН 6,8 (готовят, смешивая равные объемы 1 М Na2HP04 и 1 М NaH2P04); этот основной раствор используют для приготовления разбавленных растворов, как указано в тексте.

Методика

1. Отцентрифугированные клетки суспендируют в 25 мл физиологического раствора + ЭДТА и добавляют 0,5 мл раствора РНКазы.

2. Добавляют 1,2 мл раствора ДСН. Колбу вращают, нагревая в водяной бане при 50—60°С до завершения лизнса клеток. Методика для бактерий, не разрушающихся под действием только одного детергента, описана в разд. 22.1.

3. Вязкость лизата снижают короткой обработкой ультразвуком. При этом можно добавлять проназу Ь или протеиназу К (50 мкг/мл). Для одних микроорганизмов расщепления протеиназой не требуется, а для других оно необходимо. При добавлении протеиназы ее инкубируют с лизатом при 50 °С в течение 1 ч.

4. Добавляют 7 мл жидкого водонасыщенного фенола, встряхивают, сначала держа колбу в руке, чтобы две фазы хорошо перемешались, а затем 20 мин на качалке.

5. Центрифугируют при 17 000 g в полипропиленовой центрифужной пробирке в охлаждаемой центрифуге при 0—4°С. Осторожно сливают верхний (водный) слой (разд. 22.2.1, п. 5) и вновь наливают его в колбу.

6. Повторяют пп, 4 и 5.

7. Добавляют 2,0 мл 1,0 М фосфатного буфера. Затем добавляют 2 г (удобно пользоваться чайной ложкой с измеренным объемом) сухого гидроксилапатита. Хорошо суспендируют и осторожно встряхивают на качалке вращающего или возвратно-поступательного действия в течение 1 ч с такой скоростью, чтобы гидроксил-апатит не оседал.

8. Суспензию переносят в 50-мл полипропиленовую центрифужную пробирку и центрифугируют 2—3 мин при 5 000 g при комнатной температуре. Слой надоса-дочной жидкости (лизат) выливают в колбу (его можно использовать для повторной адсорбции ДНК), а осажденный гидроксилапатит (на котором теперь адсорбирована ДНК) используют в п. 9.

9. К осажденному гидроксилапатиту добавляют 8 мл 0,1 М фосфатного буфера. Гидроксилапатит суспендируют с помощью встряхивателя Vortex. Сразу же вливают еще 24 мл фосфатного буфера (это удобно делать с помощью автоматической пипетки). Фосфатный буфер следует вливать под давлением так, чтобы гидроксилапатит равномерно размешивался для максимального разбавления нуклеотидов и фенола. Выжидают 1—2 мин, пока гидроксилапатит осядет, и центрифугируют 2— 3 мин при 5 000 g. Надосадочную жидкость отбрасывают.

10. Процедуру, описанную в п. 9, повторяют б—7 раз до тех пор, пока оптическая плотность надосадочной жидкости при 270 нм (максимум поглощения фенола) не станет менее 0,05.

11. Для десорбции ДНК гидроксилапатит суспендируют в 5,0 мл 0,5 М фосфатного буфера. Центрифугируют, как раньше, но на этот раз надосадочную жидкость, содержащую ДНК, не выбрасывают.

12. Если большая часть ДНК не была удалена из лизата во время процедуры, описанной в п. 8, то после этапа 11 гидроксилапатит промывают один раз дистиллированной водой и затем добавляют его в лизат для второго цикла адсорбции. ДНК, полученную после второго цикла адсорбции, добавляют в первую порцию выделенной ДНК.

13. Препарат ДНК фильтруют через фильтр из стекловолокна (Reeve Angel Inc., Clifton, N. J., диаметр 2,4 см, тип 934АН) с держателем по типу шприца (Gelman Instrument Co., Ann Arbor, Mich.) для удаления остатков частиц гидроксилапатита.

14. Препарат ДНК диализуют против буферного раствора 0,02 М NaCl + 10~3 М N-2-гидроксиэтилпиперазшшатриевая соль №-2-этансульфоновой кислоты (HEPES), рН 7,0. Нарезают отрезки диализной трубки (Fisher Scientific Co., Pittsburgh) по 13—15 см и вымывают из нее УФ-поглощающие вещества. Для этого трубку в течение нескольких минут кипятят в 2— 5%-ном растворе карбоната натрия, тщательно промывая ее водопроводной, а затем дистиллированной водой. Трубки можно хранить в холодильнике в течение 2— 3 дней в дистиллированной воде. При более длительном хранении целлюлолитические организмы могут гидро-лизовать их. Конец трубки завязывают узлом, наливают в образовавшийся мешок раствор ДНК и завязывают узлом второй конец или перевязывают его бечевкой. К бечевке прикрепляют ярлык. Диализуют против 400—500 объемов буфера около 3 ч, меняют буфер и затем продолжают диализ в течение ночи. Препараты ДНК хранят в морозильнике или, добавив в них несколько капель хлороформа, в холодильнике.

Замечания

Если лизат расщепляют проназой или протеиназой К, обычно достаточно одной экстракции фенолом.

Важной чертой описанной выше методики является то, что в ходе операций молекулы РНК всех видов деградируют до такой степени, что не конкурируют с ДНК за адсорбционные центры на гидроксилапатите. Для некоторых микроорганизмов, помимо панкреатической РНКазы, может потребоваться РНКаза Т1. На этапе 1 добавляют 50—100 ед. Sankyo РНКазы Tl (Calbiochem-Behring, La Jolla, Calif.). Для ряда микроорганизмов на этапе 1 РНКаза может ингибироваться. Чтобы устранить ингибирование, лизат диализуют в течение нескольких часов против физиологического раствора + ЭДТА.

Помимо РНК, основной примесью в препаратах ДНК являются полисахариды. Многие полисахариды не адсорбируются на гидроксилапатите и поэтому легко отделяются от ДНК при добавлении к ее раствору этого сорбента. Однако некоторые полисахариды связываются с гидроксилапатитом и снижают адсорбцию ДНК.

Для успешного осуществления описанного выше метода иногда требуется более разбавленная клеточная суспензия. Очевидно, разбавление влияет на завершенность лизиса и (или) деградацию РНК. Увеличивают объемы в 4—5 раз и повторяют описанные выше этапы до стадии адсорбции на гидроксилапатите. Добавив гидроксилапатит к части лизата, суспензию гидроксила-патита вливают в 60-мл фильтр из огнеупорного стекла. После того как гидроксилапатит частично осядет, через фильтр пропускают весь лизат. Затем гидроксилапатит переносят в центрифужную пробирку и завершают процедуру, как описано выше.

Разработано много дополнительных модификаций методов выделения ДНК; некоторые из них даны в работе [30].

22.3. ВЫДЕЛЕНИЕ РНК

Большая часть нуклеиновых кислот в бактериальной клетке представлена РНК (в основном рРНК и в меньшей степени тРНК и мРНК); поэтому выделить РНК в больших количествах довольно просто. Основная проблема заключается в получении препаратов РНК, не содержащих РНКазу. Этот фермент довольно широко распространен и, кроме того, весьма устойчив к нагреванию. Со стеклянной посуды РНКаза лучше всего удаляется прокаливанием в муфельной печи или печи для стерилизации сухим жаром. Водные буферы и растворы обрабатывают вначале автоклавированием, а затем добавлением 0,2%-ного диэтилпирокарбоната [22].

Методы выделения РНК подробно описаны Кир-би [38]. Ниже приводится один из наиболее удачных вариантов метода выделения бактериальной РНК, достаточно хорошо очищенной от ДНК.

Реактивы

Нафталин-1,5-дисульфонат натрия, 10%-ный раствор (вес/объем).

Смесь фенол — крезол: 550 мл жидкого фенола, 70 мл ж-крезола и 0,5 г 8-гидроксихинолина.

Диэтилпирокарбонат (добавляют непосредственно перед лизированием клеток из-за его слабой устойчивости в воде).

Буфер SSC (разд. 22.2.1). Готовят также буфер SSC, содержащий 1%-ный ДСН.

ДСН, 20%-ный раствор (разд. 22.2.1).

Методика

1. Клетки собирают центрифугированием и промывают один раз дистиллированной водой. Суспендируют их приблизительно в 20 мл холодной дистиллированной воды и измеряют объем суспензии с помощью мерного цилиндра.

2. На каждый 1,0 мл суспензии добавляют по 0,05 мл 10%-ного нафталиндисульфоната, а также диэтилпиро-карбонат до конечной концентрации 0,2%. После этого клетки немедленно разрушают, пропуская через пресс Френча при давлении от 7*107 до 8,4 • 107 Па (700— 840 кг/см2) в сосуд, содержащий 15 мл смеси фенол — крезол, 10 мл 0,5%-ного нафталиндисульфоната и 0,02 мл диэтилпирокарбоната.

3. Колбу встряхивают 20 мин на качалке. Смесь помещают в полипропиленовую центрифужную пробирку и центрифугируют 10 мин при 17 000 g в охлаждаемой центрифуге при 0—4°С, Осторожно сливают верхний (водный) слой и сохраняют его.

4. Добавляют буфер 20 X SSC (1 часть на 20 частей воды) и ДСН до конечной концентрации 1%.

5. Добавляют 15 мл смеси фенол — крезол, встряхивают и центрифугируют при 17 000 g в охлаждаемой центрифуге. Водный слой сохраняют.

6. Добавляют 2 объема ледяного 95%-ного этанола, смешивают и оставляют в морозильнике на 30—60 мин. Центрифугируют 10 мин при 4 000 g в охлаждаемой центрифуге. Сливают надосадочную жидкость, дожидаясь полного стекания жидкости со стенок центрифужной пробирки.

7. Осадок (РНК) растворяют в 30 мл буфера SSC. Осаждение этанолом, центрифугирование и растворение повторяют до тех пор, пока надосадочная жидкость не перестанет поглощать при 270 нм. РНК хранят в буфере SSC, содержащем 1% ДСН

страница 21
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45

Скачать книгу "Методы общей бактериологии. Том 3" (2.64Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(20.11.2019)