Биологический каталог




Методы общей бактериологии. Том 3

Автор Ф.Герхардт

анаэробному катаболизму Сахаров (O/F-тест). Если известны особые физиологические свойства, присущие микроорганизму, то это облегчает его идентификацию (например, способность к азотфиксации, деградации целлюлозы, биолюминесценции, потребность в морской воде для роста, образование пигментов или потребность в геме).

Желательно использовать упорядоченный подход к идентификации, основанный на здравом смысле и на применении только тех тестов, которые имеют отношение к делу. Следует избегать подхода, который можно сравнить с «тыканьем пальцем в небо», когда применяют все виды тестов в отчаянной надежде на то, что какой-нибудь из них окажется полезным. Чрезвычайно ценными могут оказаться оглавление 8-го издания «Определителя Берги» [2] и приведенные там основные ключи, так же как общее описание различных порядков, семейств и родов бактерий. После исчерпания первоначальных возможностей можно обратиться к подробным ключам и таблицам, приводимым в различных пособиях (многие из них перечислены в списке общей литературы [1—13] в разд. 20.5.1) по идентификации родов и видов. На последних этапах идентификации новый штамм сравнивают либо с типовым штаммом

предполагаемого вида, либо с другим известным штаммом, принадлежность которого к данному виду точно установлена.

Часто (особенно в случаях с патогенными бактериями) проводят быструю предварительную идентификацию до рода или вида с помощью диагностических сывороток. Однако такие тесты бывают не абсолютно специфичными, и обычно для подтверждения полученных с их помощью результатов требуется проведение дополнительных физиологических тестов. Например, агглютинация грамотрицательных кишечных палочек поливалентной сывороткой Salmonella является предварительным свидетельством в пользу их принадлежности к роду Salmonella, но это обязательно должно быть подтверждено рядом биохимических тестов.

При проведении диагностических тестов организм, используемый для инокуляции, должен быть свежепе-ресеянным, в хорошем физиологическом состоянии. Старые накопительные культуры, которые могут содержать в большом количестве мертвые или отмирающие клетки, не пригодны для этих целей. Инокулированную диагностическую среду инкубируют в условиях, оптимальных для жизнедеятельности организмов или для проявления изучаемого свойства (например, оптимальные температура, рН, состав газов и ионный состав). Методы тестирования следует использовать не только в отношении испытуемого организма, но также и в отношении штаммов, для которых наличие или отсутствие проверяемого свойства уже известно. Такой подход обеспечивает проверку надежности реактивов и сред.

В конце этой главы приведены ссылки на общую литературу (20.5.1), где даны схемы идентификации различных групп бактерий, дальнейшая информация по методологии и дополнительные методы характеризации.

20.1. РУТИННЫЕ ТЕСТЫ

20.1.1. Окрашивание на кислотоустойчивость

Методика этого окрашивания описана в разд. 3.3.6. Положительная реакция указывает на Mycobacterium или Nocardia.

20.1.2. Образование кислот из углеводов

Метод 1. При подготовке среды в нее вводят рН-индикатор. В табл. 20.1 перечислены наиболее часто используемые индикаторы с указанием их свойств.

Метод 2. В случаях, когда индикатор токсичен для бактерий или разлагается в процессе их роста, его следует добавлять каплями (0,02—0,04%-ного спиртового раствора) в культуру после окончания роста.

Метод 3. Если применение индикатора нежелательно в силу этих же причин, а также для обеспечения более высокой точности, рН культуры следует измерять по окончании роста с помощью рН-метра. Используют длинный тонкий рН-электрод, который можно вводить прямо в пробирку с культурой. К верхней части электрода прикрепляют плоскую резиновую прокладку с большим диаметром, чем диаметр пробирки с культурой, так чтобы кончик электрода был застрахован от удара о дно пробирки. При определении рН нескольких культур патогенных бактерий между измерениями электрод погружают в стакан с дистиллированной водой. Позже эту воду автоклавируют. По окончании работы электрод промывают дезинфицирующим раствором (например, 3%-ной перекисью водорода или 70%-ным этиловым спиртом).

В случае когда анаэробные бактерии культивируют в предварительно восстановленном пептонно-дрожжевом бульоне (разд. 20.3.28) с углеводами, двуокись углерода, которую пропускают через пробирку во время инокуляции для предотвращения попадания кислорода, обычно снижает рН среды до 6,2—6,4. Вследствие этого культуры, выращиваемые на углеводном пептонно-дрожжевом бульоне, обычно считаются подкисленными, если их рН составляет 5,5—6,0 (слабая кислота) или оказывается ниже 5,5 (сильная кислота). Для культур, выращенных на пептонно-дрожжевом бульоне, содержащем арабинозу, рибозу или ксилозу, рН 5,7 или ниже обычно означает подкисление, поскольку стерильная среда, через которую пропускали двуокись углерода, после 1—2 дней инкубации имеет рН 5,9 [7]. В любом случае в качестве контроля следует определять рН

И

культур в пептонно-дрожжевом бульоне, не содержащем никаких углеводов, так как в некоторых случаях могут образовываться кислоты из пептонов.

20.1.3. Гидролиз эскулина

Культуры выращивают в бульоне или на агаровой среде с добавлением 0,01% эскулина и 0,05% лимоннокислого железа. Положительный тест: появление коричневато-черной окраски среды. Примеры: положительный результат — Streptococcus faecalis; отрицательный — Streptococcus mitis.

20.1.4. Образование аммиака из аргинина

Инокулируют аргининовый бульон (см. разд. 20.3.2 и 20.3.3) и контрольный бульон без аргинина. После инкубации в течение 2—3 дней анализируют культуры в спот-тесте с реактивом Несслера (разд. 20.4.10). Положительная реакция: появление желтой или оранжевой окраски в отличие от контроля. Примеры: положительный результат — Streptococcus faecatis\ отрицательный— Streptococcus salivarius.

20.1.5. Аргининдезиминаза

Метод 1. Этот метод широко применяется для дифференциации членов сем. Enterobacteriaceae. Инокулируют основной бульон Меадера (разд. 20.3.23) с добавлением 1% моногидрохлорида L-аргинина (или 2% DL-формы), а также контрольный бульон без аргинина. После инокуляции бульон заливают 10-мм слоем стерильного минерального (вазелинового) масла. Проверяют пробу ежедневно в течение 4 дней. Положительная реакция: фиолетовая или красновато-фиолетовая окраска. При слабой реакции образуется голубовато-серая окраска. Примеры: положительный результат — Enterobacter cloacae; отрицательный — Proteus vulgaris.

Метод 2. Этот метод пригоден для широкого круга факультативных аэробов. Инокулируют полужидкую среду Торнли, содержащую аргинин (разд. 20.3.32), а также контрольную среду без аргинина. После посева в столбик уколом среду герметично покрывают слоем стерильного растопленного петролатума и инкубируют. Положительная реакция: изменение окраски от желто-оранжевой до красной в течение 7 дней.

Метод 3 [88]. Этот метод применим для аэробов и факультативно анаэробных бактерий. Готовят густую суспензию бактерий в 0,033 М фосфатном буфере, рН 6,8 (разд. 20.4.16). В течение нескольких минут пропускают через суспензию (4 мл) азот, а затем добавляют

1 мл 0,001 М моногидрохлорида L-аргинина. Снова пропускают через суспензию азот, закрывают пробирки пробками, инкубируют в течение 2 ч и нагревают 15 мин при 100 °С. После удаления клеток центрифугированием определяют в надосадочной жидкости аргинин по методу Розенберга и др. [77]: смешивают 1 мл пробы с 1 мл 3 н. NaOH, 2 мл проявляющего раствора (разд. 20.4.4) и 6 мл воды; через 30 мин сравнивают пробирки с контрольной пробой без аргинина, используя колориметр с зеленым светофильтром (540 нм); сравнивают показания с данными, полученными для неинокулированной контрольной пробы, содержащей аргинин. Положительная реакция: исчезновение части или всего аргинина.

20.1.6. Разрыв ароматического кольца [88]

Культуру выращивают на синтетической среде, содержащей 0,1% я-гидроксибензоата натрия в качестве источника углерода, а также на агаризованном дрожжевом экстракте для определения того, является ли фермент конститутивным или индуцибельным. Соскабливают выросшие клетки с агара и суспендируют их в

2 мл 0,02 М трис-буфера, рН 8,0. Встряхивают суспензию с 0,5 мл толуола и добавляют 20 мкмолей (3,5 мг) протокатехоата натрия. Появление желтой окраски в течение нескольких минут означает расщепление ароматического кольца в мета-положении. При отсутствии изменения окраски суспензию встряхивают в течение часа при 30 °С. Добавляют 1,0 г (NH4hS04, 1 каплю 1,0%-ного нитропруссида (нитроферрицианида) и 0,5 мл нашатырного спирта (удельный вес 0,880 или 28— 30%-ный раствор). Окрашивание в пурпурный цвет означает наличие расщепления в орто-положении. Примеры: расщепление в мета-положении — Pseudomonas acidovorans; расщепление в орто-положении — Pseudomonas fluorescens; отрицательный результат -^Escherichia coli.

20.1.7. Арилсульфатаза

К стерильной жидкой среде добавляют с соблюдением правил асептики достаточное количество стерилизованного фильтрованием 0,08 М раствора дисульфата трикалийфенолфталеина (ICN Biochemicals, Cleveland, Ohio) до конечной концентрации 0,001 М. Оптимальными для синтеза арилсульфатазы являются среды, содержащие в качестве единственного источника серы метио-нин; такие источники серы, как сульфат, сульфит, тиосульфат или цистеин, могут подавлять синтез фермента [14, 60]. Среду инокулируют и инкубируют в течение 7 дней, затем добавляют по каплям 1 н. NaOH или 1 М Na2C03. Положительная реакция: окраска от бледно-розовой до светло-красной. Неинокулированная контрольная проба при такой же обработке остается бесцветной.

Примеры: положительный результат — Proteus ret-tgeri\ отрицательный — Chromobacterium violaceum.

20.1.8. Бацитрациновый тест

Используют стерильные имеющиеся в продаже диски для дифференциации, а не определения чувствительности (Difco Laboratories, Detroit, Mich.; BBL Microbiology Systems, Cockeysville, Md.), или стерильные бумажные диски, пропитанные 0,04 ед. бацитрацина (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.

страница 2
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45

Скачать книгу "Методы общей бактериологии. Том 3" (2.64Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(27.06.2022)