. В пробирках находятся агаровые среды. Система позволяет определять 9 различных свойств, две дополнительные пробирки со средами позволяют осуществлять при необходимости еще 6 тестов. В агар вводят до дна иглу с бактериями (через сужение), а затем вынимают ее и инокулируют штрихом скошенную поверхность агара. Результаты определяют через 18—24 ч [59, 78, 86].

Система Corning N/F для идентификации окисляющих грамотрицательных бактерий (Corning Medical Microbiology Products), состоящая из двух пробирок со» средами (пробирки GNF и 42Р), позволяет проводить первую оценку по результатам 5 реакций через 18—24 ч. Последующие тесты осуществляют в круглых пластмассовых чашках (чашки Uni-.N/F-Tek) с углублениями, заполненными различными агаровыми средами. В них можно провести 12 дополнительных реакций, результаты которых регистрируют через 24—48 ч. Среды в лунках инокулируют каплей бактериальной суспензии.

Система Micro-ID для идентификации бактерий сем. Enterobacteriaceae (General Diagnostics Div., Warner-Lambert Co.) представляет собой пластинку с 15 тест-камерами, содержащими диски фильтровальной бумаги, пропитанной реактивами и субстратами. Содержимое-камер инокулируют суспензией бактерий. Нанесение сверху слоя масла для защиты от кислорода не требуется. Результаты учитывают 'после инкубации при 37 °С в течение 4 ч [16].

20.2.4. Многоточечные инокуляторы

Широкое распространение имеющихся в продаже стерильных пластмассовых чашек для микротитрования-(пластмассовых чашек с 96 миниатюрными лунками, каждая объемом около 0,2 мл) привело к развитию* микрометодов, позволяющих определять образование-кислот из углеводов, образование газов и другие биохимические реакции.

Многоточечный инокулятор можно изготовить самостоятельно, вставив острыми концами булавки из нержавеющей стали с 27-мм головками в заполненные-воском лунки или чашку для микротитрования [36]. Можно также вколоть булавки или штифты в деревянную, пластмассовую или металлическую основу в точном соответствии с лунками в чашке для микротитрования [37]. Металлический инокулятор обладает теш преимуществом, что его можно автоклавировать, однако другие инокуляторы можно с успехом «стерилизовать», опуская булавочные головки в спирт и затем выдерживая их 1—2 с в пламени головками вверх [36]. Чтобы «зарядить» инокулятор, его приводят в контакт с клетками, опуская на шаблонную пластинку для микротитрования, каждая лунка которой содержит отдельный штамм бактерий; при этом на каждой булавочной головке остается около 0,006 мл культуры. Затем инокулятор приводят в контакт с пластинкой для микротитрования, лунки которой заполнены бульоном с углеводом. При этом каждая лунка с бульоном инокулируется определенным штаммом бактерий, находящимся на отдельной булавочной головке. Инокулятор вновь опускают на шаблонную пластинку для «перезаряжения» и инокулируют вторую пластинку для микротитрования, лунки которой заполнены средами с другим углеводом и т. д. Для определения образования газа из углеводов каждую инокулированную лунку покрывают стерильной смесью, содержащей 1 часть амоджела (American Oil Со.) и 1 часть вазелинового масла [38]. Инокулирован-ные чашки закрывают крышками и инкубируют. Образование кислоты определяют по изменению цвета рН-индикатора, помещенного в среду. Накопление пузырьков под верхним слоем масла свидетельствует о газообразовании.

Заполнение лунок чашки для микротитрования стерильной средой можно значительно облегчить, пользуясь многоканальной автоматической пипеткой (Cooke Engineering Co., Alexandria, Va.) или другим подобным устройством. Можно самостоятельно изготовить приспособление, описанное, например, Уилкинсом и др. [96]. Для этого берут иглы № 18 для подкожных инъекций, снимают с них наконечники и вынимают мандрены. Затем иглы припаивают медно-цинковым припоем к отверстиям на трубке из нержавеющей стали длиной 13,5 см и диаметром 7 мм так, чтобы расстояния между иглами были равны расстояниям между лунками пластинки для микротитрования (рис. 20.2). Один конец трубки оставляют открытым, а к другому концу припаивают медно-цинковым припоем соединитель типа Люер-Лок. После стерилизации всего устройства этот соединитель прикрепляют с соблюдением правил асептики к стерильному автоматическому пипеточному шприцу типа Корнуолл (Becton, Dickinson and Co., Rutherford, N.J.), снабженному стерильным шлангом для заполнения (рис. 20.2). Конец шланга погружают в колбу со стерильной средой и заполняют шприц, несколько раз оттягивая поршень. Затем восьмиигольчатую гребенку,

Рис. 20.2. Устройство для одновременного заполнения восьми лунок пластинки для микротитрования. 1 — трубка из нержавеющей стали;

2 — иглы для подкожных инъекций № 18, припаянные к трубке;

3 — пластинка для микротитрования с лунками; 4 — соединитель-типа Люер-Лок, припаянный к концу трубки; 5 — заполняющая трубка, присоединенная к шприцу типа Корнуолл; 6 — цилиндр и поршень шприца. Нажимая на поршень, одновременно заполняют стерильной средой 8 лунок.

приготовленную таким образом, устанавливают над рядом из восьми лунок на пластинке для микротитрования и надавливают на поршень шприца, вливая одновременно по 0,2 мл среды в каждое углубление. Таким же способом заполняют все остальные ряды лунок на пластинке. Устройство промывают стерильной водой (или кипятком, если в лунки вносят агаровую среду) и1 затем заполняют другой средой, которую предстоит внести в лунки.

С помощью пластинок для микротитрования можно-проводить и другие биохимические тесты. Например, тест на индол проводят, добавляя 2 капли реактива Ковача в культуры, находящиеся в лунках, а для проведения реакции Фогес — Проскауера в культуру добавляют 1 петлю а-нафтола и затем 1 петлю КОН [37]. Однако некоторые тесты нельзя проводить с помощью-пластинок для микротитрования. Например, при определении уреазы аммиак, образуемый уреазоположи-тельными микроорганизмами, может диффундировать в-соседние лунки и давать ложноположительный результат.

Для засева поверхности диагностического агара в обычных чашках Петри можно применять многоточечные инокуляторы [36, 57]. С помощью таких инокуля-торов с заостренными штифтами или булавками можно в случае необходимости инокулировать бактерии прокалыванием агара [65]. Однако при посеве различных штаммов в одной чашке может происходить чрезмерное разрастание или взаимное перекрывание колоний. Эта проблема исчезает при использовании чашек Петри, разделенных на отсеки (Dynos Plastics Ltd., Surbi-ton, Surrey England) [57], миниатюрных формочек для получения кубиков льда [36] или пластинок для микротитрования [37, 96]. На последних можно приготовить маленькие косячки, например косячки агаровой среды с тремя сахарами и железом, и инокулировать их с помощью прокалывающего инокулятора [37].

При многоточечной инокуляции анаэробов в лунки пластинок для микротитрования разливают стерильные полужидкие среды и инкубируют их с закрытыми крышками в течение ночи при 37 °С для выявления посторонних бактерий, а также для подсушивания [95]. Пластинки помещают в анаэробный бокс с перчатками и оставляют на 2 дня для восстановления сред перед инокуляцией. Пластинки инокулируют с помощью прокалывающего инокулятора внутри бокса с перчатками. Хотя каждая пластинка имеет 96 лунок, инокулируют только 48 из них (в шахматном порядке), а 48 оставляют неинокулированными в качестве контрольных лунок для обнаружения изменений рН небиологического характера или возможной миграции подвижных бактерий из одной лунки в другую. После инокуляции каждую пластинку .закрывают полоской стерильной нетоксичной пластмассовой ленты (Cooke Engineering Co.). Сначала ленту кладут на резиновую подставку липкой стороной вверх, а затем прижимают к ней перевернутую пластинку. Для того чтобы каждая лунка была плотно закрыта, по пластинке проводят роликом. Для выхода газов во время роста над каждой лункой делают отверстие с помощью ленточного перфоратора. Пластинку инкубируют в течение 3 дней в анаэробном боксе. Кжлотообразова-ние определяют с помощью тонкого рН-электрода (такого, например, как электрод S-30070-10, Sargent-Welch

Co., Skokie, 111.), который вводят в среду в каждую лунку. Можно не промывать электрод после каждой лунки, так как при каждом погружении остатки агара на кончике электрода перемещаются вверх [95].

20.2.5. Множественная инокуляция с помощью бархата

Метод множественной инокуляции с помощью бархата предназначен для определения потребностей в питании большого числа штаммов. Ниже описана методика, с помощью которой можно определить способность 267 штаммов псевдомонад к использованию 146 различных органических соединений в качестве источников углерода и энергии [88].

Готовят агаровую среду следующего состава: 40 мл буфера Na2HP04 — КН2Р04 (1,0 М, рН 6,8); 20 мл безвитаминной минеральной основной среды Хатнера (разд. 20.3.18); 1,0 г (NH4)2S04; 20 г агара и 940 мл дистиллированной воды. В среду добавляют 0,1—0,2% испытуемого источника углерода и разливают ее по чашкам Петри. Агар в стерильных чашках подсушивают инкубацией при 37 °С в течение 2—3 дней. Чашки хранят до применения (не больше 4—5 нед) в пластмассовых пакетах при комнатной температуре. Матричную чашку готовят, высевая на агаровую среду, содержащую 0,5% дрожжевого экстракта, методом «заплаток» (инокулируют лишь небольшие участки) до 23 различных штаммов бактерий. После того как появляются колонии, с помощью бархата методом отпечатков, впервые описанным Ледербергами [54], засевают вспомогательные чашки. См. также разд. 13.6.2. Согласно этому методу, кусочек стерильного бархата прикрепляют к цилиндрической болванке с диаметром, немного меньшим диаметра чашки Петри, и осторожно прижимают его ворсинками к агару в матричной чашке. Затем таким же образом прижимают его к стерильному агару в других чашках. В результате перепечатывания колонии во вспомогательных чашках имеют точно такое же расположение, как и в матричной. От одной матричной чашки можно инокулировать 9 вспомогательных чашек. После появления признаков роста культур во вспомогательных чашках каждую