следующее центрифугирование проводят на холоду..Для успешного применения этой методики необходимо, чтобы охлаждение приостанавливало процесс поглощения, но не вызывало выхода веществ из клетки. Такая процедура дает хорошие результаты чаще с грамположительными, чем с грамотри-цательными бактериями.

В некоторых случаях нет необходимости отделять клетки от раствора. Например, ионселективные электроды позволяют вести непрерывное наблюдение за рН, парциальным давлением кислорода (рОг), содержанием ионов калия и т. п. (разд. 16.2), Более того, при изучении поглощения солей часто достаточно бывает лишь следить за изменением проводимости суспендирующей среды с помощью обычной кондуктометрической ячейки.

4. Отмывка клеток

Клетки, остающиеся на фильтре, обычно необходимо промыть для удаления компонентов среды с их поверхности. Промывная жидкость должна быть осмотически забуференной, особенно для грамотрицательных бактерий, так как транспортные системы чувствительны к осмотическому давлению. Для промывания часто используются концентрированные растворы Сахаров (например, 0,5 М раствор сахарозы). Можно также добавлять ионы марганца (обычно 50 мМ) в виде хлорида или сульфата. Идеальный промывной раствор должен в основном удалять исследуемое вещество из осадка клеток и фильтра при первом же промывании. Однако обычно приходится идти на определенный компромисс (дополнительные сведения см. в разд. 19.1.1).

Иногда можно избежать необходимости промывания клеток, центрифугируя их через слой жидких силиконов, как описано Гурвицем и др. |[17]. Клетки проходят через силикон и образуют осадок, не содержащий межклеточной воды. Немного воды может остаться на поверхности клеток, и вода клеточных стенок также не удаляется.

5. Удаление клеток и их анализ на содержание исследуемого вещества

Клетки можно элюировать с фильтра, ресуспендиро-вать до известного объема и определять содержание в них изучаемого вещества химическим (гл. 17) или радиометрическим способом (разд. 16.4).

При использовании радиоактивных растворенных веществ чаще всего фильтры высушивают и помещают прямо в сцинтилляционную жидкость для счета импульсов. Можно также определить количество растворенного вещества, включенного в основные биополимеры, обработав клетки на фильтре охлажденным раствором ТХУ (разд. 17.1) и промыв затем водой перед высушиванием. Удобно пользоваться фильтрами, растворяющимися в сцинтилляционной жидкости или в растворителе, смешивающемся с этой жидкостью. Подробно об этом можно прочитать в проспектах фирм или статьях по сцинтил-ляционному счету.

Мембранные фильтры могут связывать изучаемые растворенные вещества, особенно ионизованные, и тогда нужно вносить соответствующую поправку. Степень связывания можно установить, пропустив через фильтр часть испытуемого раствора без клеток, промыв его так, как если бы в нем находились клетки, и определив количество растворенного вещества, задержанного фильтром.

19.2.2. Выражение результатов

Поглощение или выход веществ обычно выражают в пересчете на единицу веса или объема клеток или объема клеточной воды. Результаты исследования транспортных процессов можно также относить к одной клетке, что позволяет сравнивать способность различных клеток к транспорту. Чаще всего пользуются пересчетом на клеточную воду.

Полезно также определить соотношение концентраций испытуемого растворенного вещества внутри клетки и в суспендирующей среде, чтобы выяснить, имел ли место концентрирующий транспорт.

Рис. 19.2. Графическая оценка вклада диффузии в обного вещества бактериальными клетками. Поглощение,

щее поглощение растворен- i

либо общим количеством поглощенного вещества.

обусловленное транспортом, ^ равно разности между об- |-щим и пассивным поглоще- <5 нием. Его можно измерять % либо скоростью процесса, ^

При использовании растворенных веществ с радиоактивной меткой весьма желательно переводить результаты счета импульсов в молярные единицы.

Транспортные процессы обычно рассматривают как подклассы реакций, катализируемых ферментами, поэтому здесь применимы принципы и методы изучения ферментативной кинетики. Например, график двойных обратных координат Лайнуивера — Бэрка, отражающий зависимость величины, обратной скорости транспорта, от величины, обратной концентрации растворенного вещества, часто представляют собой прямые линии, позволяющие вычислить значения Км (константы Михаэлиса) и Vmax (максимальной скорости). Конкретный пример можно найти в работе Эймса [1]. Можно также построить кривые Эди—Хофсти, отражающие отношение скорости транспорта к скорости, деленной на концентрацию субстрата. Затруднения, возникающие при исследовании кинетики ферментов, встречаются и при изучении транспорта.

Нередко у клеток имеется не одна транспортная система для данного растворенного вещества. Например, многие бактерии обладают высокоаффинной транспортной системой, весьма специфичной для какой-то одной ароматической аминокислоты, а также намного менее специфичной низкоаффинной системой. Методы изучения активности таких множественных систем описаны Эймсом [1].

Многие растворенные вещества могут проникать в клетки как пассивно, путем диффузии, так и в результате активного транспорта. При высоких концентрациях субстрата диффузионные процессы обычно не приводят к насыщению; их вклад можно оценить по графику типа представленного на рис. 19.2. Если клетки интактны, процесс диффузии может включать диффузию растворенного вещества в воду клеточной стенки [29], которая у таких организмов, как Micrococcus lysodeikticus (М. luteus), может составлять около 50% объема клетки.

19.2.3. Общие замечания

Главное преимущество использования разбавленных клеточных суспензий — легкость получения данных по кинетике. Кроме того, в таких суспензиях легче контролировать р02, рН, ионную силу и т. п., а также поддерживать почти постоянную концентрацию растворенного вещества в суспендирующей среде.

Однако этот подход не лишен недостатков. К ним относятся трудности, связанные с выходом растворенного вещества из клеток во время первичного суспендиро-вания или промывания; необходимость определить поглощение или потери растворенного вещества путем измерения его внутриклеточной, а не внеклеточной концентрации; и наконец, то, что в разбавленных суспензиях клетки могут быть весьма чувствительны к изменениям условий среды.

19.3. СПЕЦИАЛЬНЫЕ МЕТОДЫ

19.3.1. Протонодвижущая сила

Протонодвижущую силу считают одним из основных средств преобразования и переноса энергии в биологических системах [31]. Ее определяют как

Д/> = Да|)-2,3^(ДрН),

где Ар — протонодвижущая сила, А ф— мембранный потенциал, R — газовая постоянная, Т — температура по Кельвину, F — число Фарадея и АрН — разность рН внутри и вне клетки. При температуре около 25°С величина 2,3 RT/F (часто обозначаемая г) составляет ~59 мВ. Таким образом, для определения Ар необходимо независимо определить А-ф и АрН.

Методы определения АФ обычно включают в себя оценку распределения какого-либо иона, который свободно проходит через клеточную мембрану. Например, Харольд и Альтендорф [16] предложили использовать для вычисления А-ф распределение хлорид-иона. Величина Аф в этом случае равна

2,3^r/F[log(ClBHeuiH)/(ClBHyTP)],

где (С1Внешн) и (С1внутр)—концентрации хлорид-иона вне и внутри клетки. Эти концентрации можно определять с помощью метода занимаемого пространства или его вариантов. В действительности следовало бы вместо концентраций хлорида использовать его активность, но определить коэффициент активности хлорида внутри клетки невозможно; он, вероятно, лишь ненамного ниже 1,0, так что активность и концентрация не сильно различаются. Активность хлорида можно определить с помощью хлоридного электрода (Orion Research. Inc., Cambridge, Mass.), а концентрацию — химическим методом [40].

Харольд и Альтендорф i[16] указывают, что хороший индикатор Д*ф должен «быстро диффундировать через мембрану... быть полностью диссоциированным при физиологических значениях рН, не нарушать процессов метаболизма и не подвергаться транслокации системами биологического транспорта». Этим требованиям может удовлетворять К4" в клетках, обработанных 1—10 мкМ валиномицином с целью сделать мембрану проницаемой для этого иона. Поскольку мембранный потенциал у бактериальных клеток обычно составляет около 180 мВ с отрицательным полюсом внутри, концентрация калия в цитоплазме клеток, обработанных валиномицином, примерно в 20 раз больше, чем в суспендирующей среде. Концентрацию калия можно определить с помощью атомно-абсорбционной спектрофотометрии, пламенной фотометрии или — менее точно — ионселективного электрода (разд. 16.2.2). Поглощение К4" измеряют методом занимаемого объема (или используют одну из его модификаций), а концентрацию вычисляют, исходя из числа молей К+, поглощаемых на единицу объема клеточной воды.

Величину Аур можно также оценить по распределению проникающих органических катионов или с помощью флуоресцентных красителей. Подробно это описано в статье Мэлони и др. [3]. В качестве проникающего аниона широко применяется тиоцианат, особенно с тех пор как он стал доступен в форме, меченной 14С; пример описан в статье Соргато и др. {42].

Для определения АрН используют слабую кислоту или основание, которые могут проникать в клетку. Выбранное соединение должно диссоциировать при физиологических значениях рН так, чтобы его распределение между клеткой и внеклеточной средой зависело от разности рН обеих фаз. Клеточная мембрана должна быть проницаемой для недиссоциировавшей формы и непроницаемой для ионизированной формы. Для определения ЛрН обычно используют ацетат, диметилсульфоксид, метиламин и салицилат. Рассмотрим уравнение Гендерсо-на — Хассельбаха для слабой кислоты. Пусть А — анионная форма, НА — недиссоциировавшая форма, а индексы i и о означают концентрацию соответственно внутри и вне клетки. Тогда

рН* = рК/ + ВДА,]/[НА,]; ?Ho-pK0+Iog[Ao]/[HAo].

Обычно считают, что рК/~рКо, и поскольку мембрана проницаема для недиссоциированной формы, то [НА/] =<[НА0]. Следовательно,

рН* -