Биологический каталог




Методы общей бактериологии. Том 2

Автор Ф.Герхардт

11 пят-нообразующих единиц в 1 мл) разводят в 10 раз раствором, содержащим 0,45 М гидроксиламин, 2 мМ ЭДТА, 10 мМ СаСЬ, и инкубируют 10—14 ч при 37 °С.

10. Смесь центрифугируют при 48 000 g в течение 1 ч для осаждения фага. Осторожно ресуспендируют осадок в 0,1 объема L-бульона, содержащего 2 мМ ЭДТА и 10 мМ СаСЬ.

11. Для удаления загрязнений суспензию центрифугируют при 15 000 g в течение 10 мин и отделяют от осадка надосадочную жидкость, в которой содержится бактериофаг. В условиях опыта жизнеспособность фага снижается примерно на 4 порядка.

12. Вновь титруют фаг, как описано выше.

Осуществление трансдукции

1. Для осуществления трансдукции [25] выращивают реципиентный штамм (Е. coll АВ2834 агоЕ) в L-бульоне (разд. 13.9.1) при 37 °С до конечной концентрации ~ 1 * 10е клетка/мл.

2. Клетки осаждают центрифугированием суспензии при 6000 g и ресуспендируют их в 0,1 объема L-бульона.

3. Смешивают 0,5 мл суспензии бактериальных клеток (~5- 10s клеток), 0,5 мл суспензии исходного подвергнутого мутагенезу фага (~5-107 пятнообразующих единиц в 1 мл) и 0,5 мл раствора 0,015 М СаСЬ и 0,03 М MgS04.

4. Смесь инкубируют при 37 °С в течение 20 мин, центрифугируют ее и дважды промывают клетки буфером М56/2 (разд. 13.9.9).

5. Ресуспендируют клетки в 1 мл буфера М56/2 и вносят аликвоты объемом 0,2 мл в чашки с минимальным агаром (разд. 13.9.10), содержащим 0,2% глюкозы и 0,3% казаминовых кислот, очищенных от примесей окрашивающих веществ. (Смешивают 3 г Norit А с 20 г казаминовых кислот, не содержащих витаминов, в 200 мл воды. Частицы активированного угля удаляют фильтрацией под вакуумом. Процедуру повторяют дважды со свежим Norit А. Таким образом получают 10%-ный обесцвеченный раствор казаминовых кислот.)

6. Инкубируют чашки около 18 ч при 30 °С или до тех пор, пока колонии трансдуцированных бактерий не станут видны невооруженным глазом.

7. Методом отпечатков переносят колонии в чашки со спектиномицином или стрептомицином (разд. 13.9.19) и в чашки с минимальным агаром (разд. 13.9.10), содержащим 0,3% казаминовых кислот.

8. Чашки с минимальным агаром инкубируют при 44 °С, а чашки с антибиотиками при 30 °С. После инкубации исходных чашек и чашек-копий при соответствующих температурах в течение еще 24 ч чашки совмещают для выявления колоний, устойчивых к антибиотикам, и колоний, не способных расти при 44 °С.

9. Отбирают отмеченные колонии из исходных чашек, очищают клоны выделением из единичной колонии и вновь проверяют на наличие различных селективных свойств.

Возможные трудности

Фаг Р1 образует очень маленькие стерильные пятна, которые трудно различить в старых чашках. Чтобы свести к минимуму эту проблему, используют только толстый слой агара (30—35 мл), залитого в чашки не ранее чем за 8—12 ч до использования. Пятна диаметром больше 1 мм наверняка относятся к примесям (обычно фаг Т1). Из лизата на одной чашке обычно имеют от Ы010 до 5-1010 фаговых частиц. Достаточное для эксперимента по локальному мутагенезу количество бактериофага Р1 получают с 20—30 чашек.

В норме трансдукция с использованием 107 фаговых частиц Р1 дает от 200 до 2000 трансдуктантов. Метод отпечатков может быть применен, если число трансдуктантов составляет менее чем 300 на чашку. Поэтому для определения соответствующего количества посевного материала рекомендуется провести пробный эксперимент. Чтобы обеспечить выделение как устойчивых к антибиотикам, так и условно летальных мутантов, следует проанализировать всего приблизительно 5000— 10000 колоний трансдуцированных бактерий.

13.8.2. Мутагенность канцерогенов

(тест Эймса)

Химические канцерогены — это вещества, с большой вероятностью вызывающие образование опухолей у лабораторных животных. Эймс и соавторы [7, 8] показали, что большинство известных канцерогенов одновременно являются и мощными мутагенами. Способ проверки, разработанный ими, включает простой посев, позволяющий оценить индукцию обратных мутаций в бактериальных генах канцерогенами. Многие канцерогены, прежде чем проявить свое канцерогенное и мутагенное действие, должны быть активированы; в живом организме такая активация обычно происходит в печени подопытного животного. С помощью рассматриваемого теста можно оценить необходимость такого рода активации включением в исследуемую пробу экстрактов печени млекопитающих, полученных после осаждения митохондрий. Около 85% всех известных канцерогенов являются мутагенами, в то время как менее 10% неканцерогенных соединений обладают мутагенным действием. Это свидетельствует об относительно высокой степени корреляции между указанными двумя свойствами, а также о том, что значительная часть опухолей млекопитающих может возникать как результат индуцированных соматических мутаций.

В тесте Эймса используется группа гистидиновых ауксотрофов Salmonella typhimurium. Штаммы этой группы имеют специфические мутации в одном из структурных генов биосинтеза гистидина, включая сдвиг рамки и мутации с заменой оснований (свойства штаммов см. в табл. 13.4). У этих штаммов нарушена система вырезания и репарации (uvrB) и система образования липополисахаридной капсулы, которая в норме покрывает снаружи бактерию (rfa). В последнее время были также получены штаммы, содержащие R-фактор (определяемая плазмидами устойчивость к антибиотикам), которые с успехом используются для выявления мутагенности нескольких классов канцерогенов.

Постановка теста заключается в смешивании бактериальных клеток с препаратом ферментов печени, полученным после осаждения митохондрий, и предполагаемым мутагеном в агаре, предназначенном для верхнего слоя, с последующим наслаиванием смеси на соответствующий минимальный агар в чашке. Существует и другой вариант, когда исследуемый агент либо в кристаллической форме, либо в каплях на дисках фильтровальной бумаги, наносят на поверхность агара, в верхнем слое которого присутствуют бактерии и ферментный препарат. Летучие соединения можно изучать при инкубации чашек, содержащих бактерии и микросомы, в эксикаторе, в замкнутое пространство которого введено исследуемое вещество. Описание дополнительных деталей постановки эксперимента в данном случае см. в работе [8].

Приготовление среды

1. В чашки Петри диаметром 100 мм и высотой 15 мм разливают по 30 мл минимального агара М56 (разд. 13.9.10), содержащего 1,5% агара и 2% глюкозы.

2. Готовят 100 мл исходного раствора агара для верхнего слоя, содержащего 0,65% агара и 0,5% NaCl (разд. 13.9.20). Добавляют к нему Ь-гистидин-НС1 и биотин до конечной концентрации 0,05 мМ каждый (приливают 10 мл исходного раствора с концентрацией обоих веществ 0,5 мМ к 100 мл агара верхнего слоя) и хранят при 45 °С до использования. Благодаря присутствию небольшого количества гистидина бактериальные клетки способны несколько раз поделиться, что усиливает мутагенный эффект исследуемых соединений.

Приготовление фракций S-9

Фракцию ферментов (называемую S-9) готовят следующим образом.

1. Индуцируют синтез микросомных ферментов печени у самцов крыс (линия Sprague-Dawley/Bio-1) весом около 200 г внутрибрюшинной инъекцией 0,5 мл раствора Aroclor 1254 (полихлорированный дифенил, 200 мг/мл в кукурузном масле).

2. Кормят крыс смесью Purina Lab Chow и позволяют им свободно пить в течение 5 дней.

3. Не дают пищи крысам в течение 12 ч, а затем забивают их оглушающим ударом по голове или декапи-тацией после цервикального смещения.

4. Извлекают из животных печени, взвешивают их, промывают стерильным раствором 0,1 М КС1, измельчают стерильными ножницами и в гомогенизаторе Потте-ра — Элвехьема с тефлоновым пестиком. При гомогенизации на 1 г сырого веса печени берут 3 объема 0,15 М NaCI; все операции проводят на льду.

5. Центрифугируют гомогенат при 9000 g в течение 10 мин и разливают надосадочную жидкость (S-9) алик-вотами по 1—2 мл в маленькие пластмассовые пробирки. Быстро замораживают их на сухом льду и хранят при —80°С до момента использования. В 1 мл приготовленного таким образом раствора с концентрацией белка около 40 мг/мл содержатся микросомы из 250 мг (сырого веса) печени.

Если имеющееся в лаборатории оборудование не позволяет выделить фракцию S-9, как описано выше, ее можно купить (разд. 13.10.2). Однако у нас нет опыта работы с имеющимися в продаже препаратами и мы ничего не можем сообщить читателю об их качестве.

Приготовление смеси S-9

Находящуюся в пробирке фракцию S-9 оттаивают при комнатной температуре, ставят в лед и используют только в течение одного дня. В эксперименте используют смесь S-9, в 1 мл которой содержатся: фракция S-9 (0,04—0,1 мл), 8 мкМ MgCU, 33 мкМ КС1, 5 мкМ глю-козо-6-фосфата, 4 мкМ NADP и 100 мкМ Na-фосфатно-го буфера, рН 7,4. Исходные растворы NADP (0,1 М) и глюкозо-6-фосфата (1 М) готовят на стерильной воде и хранят при —20 °С. Таким же образом можно приготовить, проавтоклавировать и хранить в холодильнике исходные солевые растворы (0,4 М MgCl2 — 1,65 М КС1) и фосфатный буфер (0,2 М, рН 7,4). Смесь S-9 готовят заново каждый день, ее можно хранить в течение нескольких часов во льду. Образцы смеси следует проверять на бактериальное загрязнение. В случае необходимости смесь S-9 перед использованием фильтруют через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм.

Приготовление исследуемых веществ

Вещества, подлежащие тестированию, готовят и хранят в пробирках разового пользования с завинчивающимися крышками, имеющими изнутри тефлоновое покрытие. Водонерастворимые вещества обычно растворяют в диметилсульфоксиде. В качестве других растворителей могут быть использованы формамид, rt-диоксан, этанол, диметиловый эфир этиленгликоля или ацетонитрил. Выбор растворителя зависит от растворимости исследуемого вещества. Многие вещества можно хранить при —20 °С или в холодильнике; однако вещества с высокой реакционной способностью, такие, как алкилирующие агенты, следует готовить непосредственно перед самым опытом.

Постановка опыта

1. Обычно в случае постановки опыта с посевом в чашки с агаром к 2 мл агара верхнего слоя (разд. 13.9.20) при 45 °С добавляют 0,1 мл проинкубированной в течение ночи в бульоне Oxoi

страница 8
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84

Скачать книгу "Методы общей бактериологии. Том 2" (4.15Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(24.08.2019)