Биологический каталог




Методы общей бактериологии. Том 2

Автор Ф.Герхардт

ть, используя вместо целых клеток клеточные экстракты. Накопление промежуточных продуктов и (или) кофакторов может происходить спонтанно, или его можно инициировать, используя метаболические яды или аналоги субстратов. При использовании клеточных экстрактов трудности, связанные с проникновением веществ в клетки, устраняются, что упрощает анализ. Однако ферменты изучаемого пути метаболизма не находятся при этом в своей естественной среде, и поэтому их активность может изменяться или они вообще могут быстро инактивироваться.

Использование радиоизотопов

Использование радиоизотопов, в частности соединений, содержащих 14С, 32Р, 3Н или 35S, чрезвычайно важное средство изучения путей метаболизма. Описание и оценка различных методик, разработанных для этой цели, содержатся в работах Дэгли и Чэпмена [8], Квей-ла [35], Уонга {47] и Итона [14], поэтому здесь мы рассмотрим их лишь в общих чертах.

Во-первых, следует отметить, что эти методики имеют свои трудности и «подводные камни». Главнейшая из трудностей связана с необходимостью работы с чистыми веществами. «Перед использованием радиоактивной метки необходима тщательная проверка ее чистоты, так как лучше вообще не работать, чем работать с нечистым исходным веществом» |[8]. Плакат с этим предостережением висит сейчас в моей лаборатории. Пытаясь проследить путь второй транспортной системы для глюкозо-6-фосфата, мы потеряли массу времени только на то, чтобы установить, что это артефакт, возникающий из-за присутствия небольшого количества примеси свободной 14С-глюкозы во всех препаратах 14С-глюкозо-6-фосфата, за исключением свежеприготовленных. Эти соединения мы использовали в опытах в качестве субстрата.

Даже при использовании чистых веществ проследить судьбу меченых молекул одного вида среди несметного числа взаимосвязанных и часто обратимых потоков метаболических реакций непросто. Чем быстрее метаболиты входят в активные метаболические пулы, тем труднее выявить их специфические функции. Поскольку активно делящиеся бактерии (в отличие от покоящихся клеток) прежде всего осуществляют реакции синтеза, оборот и перераспределение метаболитов у них сводится к минимуму. Поэтому для радиоизотопного анализа путей метаболизма рекомендуется использовать по возможности активно делящиеся бактерии. Полезно также

Рис. 18.9. Путь биосинтеза аминосахаров. N-АцГА — N-ацетилглюкозамин; ФФТС — фосфоенолпиру-ват-фосфотрансферазная система; N-АцГА-б-Ф — N-аце-тилглюкозамин-6-фосфат; ГА-6-Ф — глюкозамин-б-фосфат; Фр-6-Ф — фруктозо-б-фосфат; ГА-1-Ф — глюкоз-амин-1-фосфат; СоА — ко-фермент А; N-АцГА-ЬФ— N-ацетилглюкозамин-1 -фосфат, UTP — уридинтри-фосфат; UDP-N-АцГА — уридиндифосфат К-ацетил-глкжозамина, ФЕП — фос-фоеиолпируват; UDP-N-Аце-тилмурамовая кислота — уридиндифосфат N-ацетил-мурамовой кислоты.

N-АцГА

сер орил иооба чие через ФФТС *

М АиГА G-Ф I

деацепилаза ^ Аиетагп

т

ГА б Ф -ГД 6-Ф * Ф0-6 Ф 4 NH"-* Гликолиз Деоаминазз г

\

ГА1-Ф

sАцетил СоА

N АцГА-1 Ф /-UTP

UDP-N АцГЛ

UDP Н-Ац^гилнурамобая кислота

Полимеры амин^ахароЬ 6 клеточый cnitntte

использование соответствующих мутантных штаммов с дефектом, который снижает до минимума или исключает распределение и (или) оборот метаболитов.

На примере биосинтеза аминосахаров можно показать преимущества, получаемые при использовании радиоактивной метки в экспериментах с соответствующими мутантными штаммами. N-Ацетилглюкозамин транспортируется в клетки с помощью фосфоенолпируват-фос-фотрансферазной системы и затем подвергается 1) диссимиляции посредством вступления в гликолитический путь через дезаминирование глюкозамин-6-фосфата с образованием NH4+ и фруктозо-6-фосфата и 2) ассимиляции с образованием макромолекул аминосахаров согласно пути, показанному на рис. 18.9.

Существуют мутантные штаммы Е. coli дефектные по N-ацетилглюкозамин-б-фосфатдеацетилазе или глюкозамин-6-фосфатдезаминазе [48]. Рост бездеацетилазного мутанта на среде, содержащей подходящий источник углерода и энергии (например, глюконат), в присутствии N-ацетил-(1-14С)-глюкозамина приводит к накоплению N-ацетилглюкозамин-б-фосфата, т. е. ассимиляция 14С отсутствует. Вместе с тем мутант, не содержащий дезаминазу, специфически включает метку в метаболиты пути биосинтеза аминосахаров.

Эти мутанты уже были использованы в ряде экспериментов [12, 13], но возможности подобного способа введения метки в определенный путь метаболизма еще далеко не исчерпаны.

В ряде случаев успешно применяется метод быстрого отбора проб. Он оказался эффективным при изучении пути фиксации 14С02 одноклеточными зелеными водорослями. С его помощью был обнаружен глиоксалатный цикл у Pseudomonas я других организмов. Согласно этому методу, радиоактивную метку добавляют к клеткам на очень короткое время (секунды или минуты), а затем сразу же определяют меченые продукты.

Для анализа путей метаболизма можно также использовать метод конкуренции изотопов. Этот метод основан на том, что при мечении всех компонентов, участвующих в определенном пути метаболизма, добавление немеченого компонента вызывает пропорциональное снижение удельной радиоактивности всех метаболитов начиная с добавленного, Роберте и др. [38] широко и успешно применили этот метод в своих классических исследованиях биосинтеза аминокислот у Е. coli.

Метод радиореспирометрии, разработанный Уонгом [47], относится к классу методов, с помощью которых можно измерять дыхательную активность биологической системы. С его помощью изучают скорость и степень превращения 14С-субстрата (например, 1-14С-глюкозы, 3,4-14С-глюкозы или ОЬ-1-14С-глутамата) в С02, выделяющийся при дыхании. Этот метод используется для анализа путей катаболического дыхания у дрожжей и различных бактерий, включая среди прочих Brevibacte-rium, Arthrobacter, Xanthomonas, Corynebacterium, Neisseria и Escherichia. Он широко применяется для определения потока углерода через взаимосвязанные пути, такие, как путь Эмбдена — Мейергофа — Парнаса, путь

Энтнера — Дудорова, пентозофосфатный путь, путь глю-куроновой кислоты и цикл трикарбоновых кислот.

Как и другие методы исследования, радиореспиромет-рия имеет определенные недостатки и ограничения. Как правило, он требует изготовления специального оборудования, которого нет в продаже. Его, впрочем, можно изготовить с минимальными затратами, как, например, в случае блока с шестью сосудами, сделанного в моей лаборатории (рис. 18.10). Стеклодув может легко превратить 250-мл колбы Эрленмейера в сосуды для радиореспирометрии, а обычные хроматографические колонки— в устройства для улавливания СОг. Список необходимого оборудования включает измеритель потока газаг термостатируемую качалку, штатив для укрепления измерителя потока и поглотителя СО2, и жидкостный сцинтилляционный счетчик. Ограниченность использования этого метода обусловлена тем, что некоторые соединения, специфически меченные 14С, которые могут потребоваться при проведении определенных работ, отсутствуют в продаже.

Использование индуцированных ауксотрофов

Принципы, лежащие в основе применения ауксотроф-пых мутантов для изучения различных метаболических путей, в частности путей биосинтеза, хорошо известны, а подробности отбора и использования таких мутантов описаны в другом разделе руководства (разд. 13.6.2). Рассмотрим последовательность пути биосинтеза:

Ei Е2 Е3 Е4

А —> В »* С * D > Е,

где Е — конечный продукт, необходимый для роста культуры. Любая мутация, влияющая на фермент Еь Е2, Е3 или Е4, приведет к остановке роста культуры, если только не будет обеспечено поступление соответствующего метаболита из другого источника. Этот метаболит, естественно, должен транспортироваться в клетки. Метаболиты, образующиеся перед поврежденной стадией, при наличии достаточных количеств ростовых субстратов будут накапливаться в высоких концентрациях. Идентификация накапливающихся метаболитов и метаболитов, стимулирующих рост мутантных клеток, наряду с соответствующими исследованиями фермента может дать существенную информацию о последовательности реакций данного пути метаболизма. Такие методики с использованием мутантов с большим успехом применяются при изучении синтеза аминокислот с разветвленной цепью, в том числе ароматических аминокислот.

18.5.2. Баланс изотопного углерода

Общие замечания

Представьте следующую гипотетическую ситуацию: вы выделяете культуру новой бактерии, о которой не знаете ничего, кроме того, что она растет в комплексной среде неопределенного состава, содержащей глюкозу. Ваша задача — описать в общих чертах пути метаболизма этой бактерии. Как бы вы приступили к решению этой задачи? Прежде всего возникают вопросы: какие биоэнергетические пути использует бактерия; какое количество углерода глюкозы ассимилируется при биосинтезе, если только это вообще имеет место; в какие мак-ромолекулярные компоненты включается углерод? Чтобы справиться с поставленной задачей, потребуется ответить на все эти вопросы (как и на многие другие, естественно). Экспериментальное определение радиоизотопного баланса служит серьезным фундаментом, на основе которого можно сделать попытку решить эту задачу. Культуру выращивают в течение времени, достаточного для диссимиляции 30—70% добавляемой глюкозы, меченной 14С (равномерно или специфически в положениях С-1, С-3,4 или С-6). В конце выращивания подводят баланс 14С. Полученные при этом данные служат отправной точкой в определении путей метаболизма.

Эксперимент такого рода можно успешно осуществить с культурами дикого штамма Е. coli ML 30 следующим образом. Культуру Е. coli в фазе экспоненциального роста переносят в радиореспирометрический сосуд (удобно использовать для этой цели 125-мл колбы Эрленмейера), устроенный таким образом, чтобы был возможен непрерывный ток газа (N2, N2—СО2, воздуха, 02 и т. д.) и отбор образующегося 14С02 (рис. 18.10). Для добавления субстрата целесообразно снабдить колбы боковыми отводами (закрывающимися газонепроницаемыми пробками, например пробками от пенициллиновых флаконов). Если использовать сосуды с двумя газовыми ловушками, соединенными с

страница 76
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84

Скачать книгу "Методы общей бактериологии. Том 2" (4.15Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(16.06.2019)