Биологический каталог




Методы общей бактериологии. Том 2

Автор Ф.Герхардт

крипция. В отсутствие индуктора (деиндукция) или при уменьшении образования сАМР из-за ингибирования аденилатцик-лазпой активности (катаболитпая репрессия) транскрипция предотвращается. Аденилатциклаза — это связанный с мембраной фермент, катализирующий превращение АТР в сАМР и пирофосфат. Этот фермент обычно активен во время роста культуры в различных средах, и поэтому клетки образуют сАМР в достаточном количестве. Однако в присутствии некоторых субстратов, например глюкозы или маннита, активность фермента ин-гибируется и образование сАМР снижается (это явление называют катаболитной репрессией).

Основные черты этих регуляторных явлений можно продемонстрировать в серии опытов, в которых следят за синтезом р-галактозидазы, как описано выше (с использованием клеток, обработанных толуолом), при регуляции экспрессии /ас-оперона. Обычно используют штаммы Е. coli К-12, Е. coli ML30 или другие дикие штаммы. Клетки быстро растут в солевой среде, содержащей 0,25—0,50% безвитаминного гидролизата казеина (гидролизоваиного кислотой) в качестве единственного источника углерода и энергии (разд. 18.4.2). В этих условиях синтез р-галактозидазы при добавлении 1 мМ изопропил-р-0-тиогалактопиранозида в качестве дополнительного индуктора почти не репрессируется.

Аэробную культуру выращивают в течение ночи (15— 17 ч при 37 °С) в указанных выше условиях, клетки собирают центрифугированием, суспендируют в стерильном 0,05 М калий-фосфатном буфере, рН 7,5 (или физиологическом растворе), и инокулируют ими среды, состав которых дан в табл. 18.2 (в 125-мл колбы).

В 0 мин и затем с 20—30 мин интервалами отбирают пробы по 1,0, 0,50 или 0,20 мл и добавляют их соответственно в 4,0, 4,5 или 4,8 мл 0,05 М натрий-фосфатного буфера, рН 7,5, для получения разведений культуры 1:5, 1:10 или 1 : 25. Начинают с разведения 1 : 5 и затем переходят к большим разведениям, когда в предыдущем оптическая плотность при 420 нм достигает значения 0,50. Для каждого разведения записывают значения А420 и используют их для подсчета сухого веса клеток на основе калибровочной кривой, отражающей зависимость между А420 и сухим весом клеток. Эти же разведения обрабатывают одной каплей толуола и одной каплей 0,1%-ного дезоксихолата натрия и инкубируют со встряхиванием при 37 °С в течение 15 мин. После инкубации до отбора аликвот (по 0,20 мл) для последую8 К этой культуре сАМР добавляют приблизительно через 150 мин после внесения IPTG.

Клетки добавляют к смесн основной среды, воды и гидролнзата казеина и подращивают их около 60 мин, В конце инкубации добавляют IPTG и другие соединения, как указано. Этот момент принимают за точку отсчета времени эксперимента.

щего анализа на р-галактозидазу (разд. 18.2.8) пробы помещают в ледяную баню.

Строят график роста каждой культуры (на полулогарифмической бумаге), по оси ординат откладывая количество клеток (сухой вес) в мкг/мл, а по оси абсцисс— время. Еще один график строят на миллиметровой бумаге, откладывая по оси ординат суммарное количество фермента в 1 мл культуры, а по оси абсцисс— количество клеток, сухой вес в микрограммах на 1 мл культуры. Наклон этого графика Р соответствует скорости синтеза фермента. После расчета удельной активности при каждом определении [в единицах активности на 1 мкг клеток (сухой вес)] строят график зависимости этой величины от времени.

При сравнении культур 1 и 2 выявляется необходимость индуктора для синтеза р-галактозидазы, при сопоставлении культуры 3 с культурой 2 четко видна репрессия глюкозой, а при сопоставлении культуры 4

Рис. 18.7. Регуляция /ас-оперона Е. coli циклическим АМР. Все культуры индуцировали IPTG {изопропил-{3-Е)-тиогалактопиранозндом), за исключением культуры Л Среда с культурой 2 в качестве единственного источника углерода и энергии содержит гидро-лнзат казеина. Среда с культурой 3 имеет тот же состав, что и среда с культурой 2, но в нее добавлена еще глюкоза. Среда с культурой 4 имеет тот же состав, что и среда с культурой 3, но в нее добавлен

еще сАМР. Среда с культурой 5 I имеет тот же состав, что и среда Сухой вес *с культурой «9, но через 1—2 ч после начала индукции в нее внесена глюкоза. Среда с культурой 6 имеет тот же состав, что и среда с культурой 4, но через 1—2 ч после начала индукции в нее внесен сАМР.

с культурой 2 обнаруживается снятие этой репрессии экзогенным сАМР. Культуры 5 и 6 демонстрируют репрессию и дерепрессию синтеза р-галактозидазы в различные отрезки времени и в более выраженном виде. Результаты подобного эксперимента представлены на рис. 18.7.

Возможны варианты описанной выше постановки эксперимента, например, можно применять другие субстраты, менять аэробные условия на анаэробные и нао-оборот, использовать различные мутантные штаммы (например, мутанты суа и сгр и т.д.). Ставя подобные эксперименты, можно изучать регуляцию других ферментных систем, например системы, кодируемой опероном L-арабинозы (ага), или деградирующую треониндегидра-тазу, образующуюся только в анаэробных условиях.

18.5. АНАЛИЗ ПУТЕЙ МЕТАБОЛИЗМА

Ферменты существуют не в виде отдельных самостоятельных компонентов, функционирующих независимо и случайно, а в виде ансамблей, отдельные элементы которых взаимосвязаны и выполняют свои функции взаимозависимо в определенной последовательности. Бакте

риальную клетку можно в действительности рассматривать как одну большую многоферментную систему, работе которой присуща определенная гармония. Помня о целостности системы, в практической работе мы, однако, вынуждены иметь дело с отдельными группами реакций, составляющими те или иные пути метаболизма. Путями метаболизма обычно называют последовательность координированных реакций, имеющих биосинтетическое или биоэнергетическое значение, например цепь переносчиков электронов, гликолитический путь или пути биосинтеза аминокислот с разветвленными цепями. Именно изучение таких путей, а не исследование отдельных ферментов способствовало накоплению современных знаний о метаболизме бактерий.

Подробный анализ и оценка имеющихся в настоящее время методик изучения путей метаболизма даны в работе Дэгли и Чэпмена [8]. В последующих разделах данной главы кратко обсуждаются общие методы, описанные этими авторами, и достаточно подробно описано оборудование для радиоизотопных работ. Это поможет получить общее представление о методах изучения путей метаболизма.

18.5.1. Общие методы

Идентификация промежуточных продуктов

В процессе катаболизма некоторых субстратов растущими или покоящимися бактериальными клетками в среде могут накапливаться промежуточные продукты, где их легко идентифицировать различными химическими, хроматографическими или радиоизотопными методами. Один или несколько промежуточных продуктов будут накапливаться в том случае, если скорость их синтеза превышает скорость диссимиляции в ходе последующих реакций определенного пути метаболизма. Когда происходит исчерпание исходного субстрата, как показано на рис. 18.8, накопление часто сопровождается потреблением. Например, культуры Е. coli, растущие на богатой среде с глюкозой в качестве основного источника углерода и энергии, накапливают и затем утилизируют пируват. С помощью такого типа исследований получена существенная информация о путях метаболизма, связанных с разложением ароматических веществ.

Использование ингибиторов метаболизма

В исследованиях путей метаболизма широко используются ингибиторы. При добавлении в культуру ингибитора какого-либо этапа пути метаболизма может происходить накопление одного или нескольких метаболитов, образовавшихся до этого этапа, которые благодаря такому накоплению легко идентифицировать. Получаемую при этом информацию можно использовать для установления последовательности реакций. Например, наши знания о химической природе стенок микробных клеток основаны на том наблюдении, что при обработке клеток Staphylococcus aureus, Streptococcus faecalis или E. coli такими антибиотиками, как пенициллин, бацитрацин или циклосерин, накапливаются различные нуклеотиды, участвующие в биосинтезе клеточных стенок. Если ингибиторы (метаболические яды) оказываются эффективными в подобных исследованиях, очевидно, клетки должны быть проницаемыми для них. При оценке данных, получаемых с использованием ингибиторов, всегда следует проявлять осторожность, поскольку могут существовать неизвестные этапы ингибирования.

Использование аналогов субстрата

Ферменты определенного пути метаболизма могут различаться по субстратной специфичности. Например, может оказаться, что первые три фермента способны взаимодействовать с аналогом природного субстрата, а четвертый — нет. В этом случае будет накапливаться частично метаболизированный аналог, который несложно идентифицировать, благодаря чему легче определить место соответствующих реакций в цепи метаболизма.

Одновременная адаптация

Метод одновременной адаптации основан на следующем логическом построении. Если индуцибельный дис-симиляционный путь (например, А—>~В—vC—*D—> цикл трикарбоновых кислот) индуцируется необходимым для роста субстратом А, у клеток развивается способность к диссимиляции метаболитов В, С, D, так же как и А, но не других веществ, не являющихся промежуточными продуктами этого пути метаболизма. Если, например, путь включает окисление всех указанных компонентов, можно ожидать окисления [измеряемого с помощью аппарата Варбурга (разд. 16.6) или кислородного электрода (разд. 16.2.3)] субстратов А, В, С и D, но не Е, F и G, если только клетки не способны конститутивно утилизировать одно или несколько из последних веществ. Такую способность можно определить с помощью теста на их окисление, используя клетки, выращенные не на субстрате А. Не исключено, однако, что субстраты В, С или D, являясь компонентами пути, не могут проникать в клетки и вследствие этого не будут подвергаться окислению. Для определения этой возможности необходимо использовать клеточные экстракты или пермеабилизоваиные клетки, обработанные с целью повышения проницаемости.

Использование клеточных экстрактов

Большинство описанных выше методик можно осуществи

страница 75
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84

Скачать книгу "Методы общей бактериологии. Том 2" (4.15Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(24.08.2019)