в:

Фосфорилирование ADP-Рибозилирование Аденилирование Уридилирование Конверсия сульфгидрила

Названия видам аллостерической регуляции даны в соответствии с тем, какое положение занимает эффектор в метаболическом пути (дальнейшее обсуждение этого вопроса см. в работах [2, 16, 21, 40, 44 и 46]. При современном уровне биохимических знаний in vivo трудно анализировать процессы регуляции, а иногда и невозможно. Иногда возникает вопрос, действительно ли эти процессы имеют место в бактериальных клетках или они существуют лишь в воображении исследователя, но мы не будем здесь его обсуждать. К перечисленным выше видам регуляции следует относиться критически. При изучении аллостерической регуляции обычно провоРис. 18.2. Влияние положительных и отрицательных эффекторов на аллостери-ческую регуляцию ферментативной активности.

СУБСТРАТПРОДУКТ

Рис. 18.3. Регуляция ферментативной активности с помощью ковалентной модификации. В простейшем виде этот процесс включает участие ин активирующего, или модифицирующего, фермента, который катализирует ковалентиое (Е+Х-»-ЕХ) изменение основного фермента, а также активирующего, \ фермента, который катализирует обратный процесс (ЕХ-*-Е+Х), восстанавливая тем самым исходную ферментативную активность.

дят эксперименты in vitro. К реакционной смеси добавляют соединения, которые предположительно участвуют в регуляции — так называемые эффекторы, — и изучают их влияние на общий ход реакции. При аллостерических взаимодействиях влияние этих эффекторов наблюдается сразу же; оно обратимо и зависит от их концентрации.

Для аллостерических ферментов график зависимости начальной скорости реакции от концентрации субстрата имеет сигмоидную форму, тогда как для обычных ферментов он имеет вид гиперболы. Вероятно, это происходит потому, что субстрат, помимо собственной функции, выполняет функцию эффектора. Однако сигмоид-ная форма может быть обусловлена не только этим. Влияние положительных (ускоряющих) и отрицательных (ингибирующих) эффекторов на аллостерическую регуляцию иллюстрирует рис. 18.2 Подробно этот вопрос рассматривается в работах [2, 16]. По сравнению с контролем, когда эффекторы отсутствуют, для достижения необходимой скорости реакции в присутствии отрицательного аллостерического эффектора необходимы большие концентрации субстрата, а в присутствии положительных эффекторов — меньшие. Предполагают, что это обусловлено связыванием различных эффекторов со специфическими сайтами узнавания на ферменте. Такое взаимодействие приводит к конформационным изменениям в молекуле фермента, что отражается на его способности связывать субстрат и на скорости реакции.

В процессе регуляции ферментативной активности путем ковалентной модификации {21] происходит кова-лентное связывание лиганда с ферментом, а не простое обратимое, как при аллостерической регуляции. Это ко-вглентное связывание катализируется другим ферментом, как показано на рис. 18.3. Активный (взаимно превращаемый) фермент превращается в неактивный с помощью другого фермента (инактивирующего), который ковалентно модифицирует первый. Другой фермент (активирующий) катализирует переход фермента в исходное активное состояние путем удаления появившихся ковалентных связей.

Эксперименты, иллюстрирующие оба типа регулятор-ных процессов (путем аллостерического и ковалентного связывания эффекторов), описаны ниже.

18.3.2. Аллостерическая регуляция

(простое ингибирование конечным продуктом)

Для определения треониндегидратазы (синтезирующего фермента Е. coli) можно использовать клеточные экстракты или лизированные клетки, как было описано

ранее. Способность L-изолейцина аллостерически инги-бировать этот фермент можно продемонстрировать в следующем эксперименте (Умбэргер, личное сообщение) .

Пробирки с компонентами, перечисленными в табл, 18.1, инкубируют при 37 °С до 20 мин (в зависимости от активности экстракта). Затем реакцию останавливают добавлением 0,1 мл 50%-ной (вес/объем) ТХУ. Отбирают часть реакционной смеси (опять же в зависимости от активности фермента) и разбавляют ее водой до 1,0 мл. Добавляют 3,0 мл 0,025%-ного раствора 2,4-ди-нитрофенилгидразина в 0,5 М НС1 и оставляют смесь при комнатной температуре на 15 мин. Добавляют 1 мл 40%-ной КОН, встряхивают и измеряют оптическую плотность в колориметре Клетта — Саммерсона (фильтр 54) или в любом другом спектрофотометре или колориметре при 540 нм. Количество микромолей а-кетобутирата, образовавшегося в реакционной смеси, определяют по ранее полученной калибровочной кривой. При такой постановке пробы могут содержать разное количество субстрата и эффектора. Результаты откладывают в виде кривой, как показано на рис. 18.2.

18.3.3. Аллостерическая регуляция с помощью энергетического заряда

Аткинсон [2] предположил, что различные ключевые ферменты, участвующие в биоэнергетических и био-синтезирующих процессах, аллостерически регулируются в ответ на энергетический заряд клетки. Энергетический заряд равен сумме молярной фракции АТР и половины молярной фракции ADP (поскольку 2 моля ADP можно преобразовать в 1 моль АТР через аденилаткина-зу), деленной на общее количество молей аденилатов:

Энергетический заряд = (АТР + 1 /2ADP)/(ATP + ADP + AMP).

Эта гипотеза основывается на том, что аденилаты составляют общий пул взаимосвязанных конечных продуктов и поэтому могут регулировать различные ключевые реакции, регенерирующие энергию (Р-реакции) и утилизирующие ее (У-реакции), как показано на рис, 18.4. АТР — это конечный продукт Р-реакций, а ADP и AMP — конечные продукты У-реакций. Первый тип реакций характеризуется высоким энергетическим зарядом, а второй — низким. Считается, что регуляция таких ферментов, как фосфофруктокиназа, пируваткина-за и цитратсинтетаза происходит с участием энергетического заряда.

Для измерения ответа фермента на изменения энергетического заряда готовят реакционную смесь с постоянным суммарным содержанием аденилатов (АТР + + ADP + AMP) при нужных значениях энергетического заряда. Величина этого пула у различных видов клеток обычно варьирует от 2 до 5 мМ. Для получения трех-компонентной смеси с заданной величиной энергетического заряда к смеси AMP—АТР добавляют молярную фракцию АТР, соответствующую необходимой величине энергетического заряда, а также аденилаткиназу и инкубируют достаточно долго для установления равновесия. Используют различные концентрации Mg2+ и субстрата (ов). Присутствие субстрата в различных концентрациях необходимо потому, что наиболее распространенным ответом ферментов на изменение энергетического заряда является, по-видимому, изменение сродства к одному или нескольким субстратам.

АТР

Начальную скорость реакции при каждой концентрации субстрата можно отложить на графике в виде функции энергетического заряда. Совокупность таких кривых для каждой концентрации субстрата отражает влияние энергетического заряда на изучаемый фермент.

Таким способом по описанной выше методике рекомендуется определять фос-фофруктокиназу. Для сравнения можно использовать другой фермент, заведомо нечувствительный к регуляции с помощью энергетичекого заряда. Эти эксперименты не относятся к разряду простых и быстрых экспериментов, которые можно проводить для удовлетворения любопытства. Они могут служить информативным и полезным средством приобретения опыта изучения ферментов и уточнения некоторых контрольных параметров.

18.3.4. Регуляция с помощью ковалентной модификации

(аденилирование)

Глутаминсинтетаза занимает центральное место в метаболизме азота у Е. coli и других бактерий. Это проявляется в том, что и синтез, и каталитическая активность этого фермента контролируются множеством процессов. Его синтез регулируется с помощью репрессии/дерепрес-сии, а активность — рядом конечных продуктов через сложный путь различных эффекторов, а также с помощью ковалентной модификации. В этой модификации участвует сложная система активирующих и инактиви-рующих ферментов, а также различные эффекторы, как показано на рис. 18,5.

12 Глутаминсинтетаза

Аденилилтрансорераза

12 глутаминсинтетаза-АШ

12 АТР

1ZPP,

4UTP

4UMP

Уридилилтрансорераза

Фермент, удаляющий уридилил

4 PR

ЧН,0

РП-ЙМР]4

12 Глутамин-синтетазя-АМР

Аденыли лтрансореразо

12 Глутаминсинтетаза

12 Р.

12ADP

Рис. 18.5, Регуляция глутаминсинтетазы с помощью ковалентной модификации. Конвертирующий фермент (аденилилтрансфераза) с помощью 12 молекул АТР катализирует аденилирование каждой из 12 субъединиц глутаминсинтетазы. Эта ковалентная модификация инактивирует А^2+-зависимук> глутаминсинтетазу. Активность аде-нилилтрансферазы регулируется с помощью превращений белка Рц, который активирует ее. Когда белок Рц ковалентно модифицируется другим ферментом (уридилилтрансферазой) до уридилированной формы [Pii-(UMP)4], он активирует катализируемое аденнлтранс-феразой деаденнлирование глутаминсинтетазы, восстанавливая тем самым ее нормальную биосннтезирующую активность [44].

Инактивацию глутаминсинтетазы путем аденилиро-вания можно продемонстрировать in vitro, как это сделано в работе Меке и др. [30] или в других работах. In vivo это осуществили в условиях аммиачного «шока» следующим образом.

Дикий штамм Е. coli вырастили в минеральной среде (как описано выше) с добавлением 0,4% глюкозы в качестве источника углерода и 0,2% L-глутамина в качестве источника азота до середины фазы экспоненциального роста. Отобрали пробу для анализа, а оставшуюся культуру разделили на две части. Одну часть оставили необработанной, а ко второй добавили 15 мМ (конечная концентрация) (NH4)2S04. Инкубацию продолжали 5—10 мин, затем пробы отобрали для обработки бромидом гексадецилтриметиламмония и анализировали на глутаминсинтетазную активность с помощью глута-милтрансферазного теста с использованием целых клеток, как описано ранее (разд. 18.2.11). Каждую пробу (10 мл) сразу же вносили в колбу, содержащую бромид гексадецилтриметиламмония с конечной концентрацией 90 мкг/мл, встряхивали 1—3 мин при 30 °С и готовили для определения активности фермента (разд. 18.2.11). Активность фермента определяли в присутствии и в