Биологический каталог




Методы общей бактериологии. Том 2

Автор Ф.Герхардт

Co., Westwood, N. J.) вносят с помощью микропипетки или шприца для газового хроматографа 0,05 мл трис-буфе-ра, по 0,01 мл MgCb, АТР, фосфоенолпирувата, глута-тиона и NADH, 0,5 мкл лактатдегидрогеназы, а также воду, киназную фракцию и субстрат до конечного объема 0,15 мл. При таком объеме реакционной смеси пучок света должен быть очень узким. Для ежедневного определения большого количества проб реактивы объединяют, чтобы снизить число необходимых добавок. Реакцию начинают добавлением субстрата. Каждый опыт должен иметь контроль на: 1) суммарную скорость реакций, катализируемых NADH-оксидазой и аденозин-трифосфатазой, путем проведения реакций в отсутствие субстратов и 2) восстановление NADH-связанного субстрата (если это возможно) путем проведения реакций в отсутствие АТР.

Удобным вариантом этой методики является сильное снижение скорости окисления NADH путем замены NADH на NADPH. Лактатдегидрогеназа реагирует с NADPH со скоростью, составляющей примерно 10% скорости реакции с NADH. Поскольку NADPH-оксидаз-ная активность в бактериальных экстрактах обычно очень низка, единственное, что нужно для устранения излишне высокой скорости окисления NADH, — это компенсаторное увеличение (приблизительно в 100 раз) содержания лактатдегидрогеназы. При сопряженном анализе с использованием лишь одного вспомогательного фермента обычно достаточно его добавления в постепенно увеличивающихся количествах до тех пор, пока не будет возможным точное определение линейной начальной, скорости основной реакциц. Методика определения времени, необходимого для Достижения линейной скорости реакции, и количества каждого вспомогательного фермента, добавляемого в реакционную смесь, разработана и описана Мак-Клуром [29].

Общие замечания

Комиссия по ферментам Международного биохимического союза рекомендует во всех случаях считать единицей ферментативной активности количество микромолей субстрата, потребляемого в 1 мин (или продукта, образующегося в 1 мин). На практике, однако, активность ферментов часто выражают в других единицах, взятых из оригинальных статей, опубликованных в различных журналах. Поэтому и в описанных ниже методиках приводятся различные единицы активности (в том виде, в котором они даются авторами). Однако, где это возможно, следует использовать активность ферментов в международных единицах.

Необходимо еще раз предупредить читателя о том, что собранные здесь методики определения активности ферментов нельзя считать догмой. Каждая методика была разработана (в большинстве случаев) для определения конкретного фермента в данной бактерии (в частности, Е. coli), поэтому не будет излишним подчеркнуть, что условия, необходимые для получения максимальной активности фермента у бактерии одного вида, не обязательно окажутся оптимальными для того же фермента у бактерии другого вида. Применение методик без учета конкретных особенностей бактерий может привести к ошибочным выводам.

18.2.2. Общие меры по стандартизации

При определении удельной активности фермента в клетках необходимо учитывать ряд факторов. Прежде всего, следует использовать насыщающие концентрации субстратов. В этом случае возможно определение количества единиц ферментативной активности, присутствующих в данном препарате, при условии линейной зависимости активности как от времени реакции, так и от количества присутствующего фермента, Выполнение этого условия проверяют эмпирически для каждого^случая. В описываемых ниже экспериментах наглядно демонстрируется, какие именно способы применяют обычно для этой цели, а также каковы различия между ферментативной и удельной ферментативной активностью. Для опытного сотрудника эта разница очевидна, но для начинающего студента она может стать источником значительных затруднений.

В приведенных ниже примерах с р-галактозидазой в качестве источника ферментов использовали обработанные толуолом клетки Е. coli. Методика определения удельной активности фермента и обработка клеток толуолом описаны в разд. 18.2.8.

Стандартизация определения $-галактозидазы

у Е. coli

Используют любой дикий штамм Е. coli и выращивают две культуры по 100 мл (А и Б) при сильном встряхивании в течение ночи (37°С). В обеих культурах индуцируют синтез р-галактозидазы внесением в культу-ральную среду 2,5 мМ изопропил-р-О-тиогалактопира-нозида в качестве индуктора. Синтез фермента культурой Б снижается при добавлении в среду 20 мМ глюкозы. Удобно пользоваться основной средой, содержащей в 1 л: 2 г КН2Р04, 7 г К2НР04, 1 г (NH4)2S04, 0,1 г MgCh*6H20 и 2,5 г безвитаминного ^идролизата казеина. Доводят рН среды до 7,2. В этих условиях синтез р-галактозидазы почти не подавляется. Культура А дает более чем достаточно клеток для последующих опытов. Клетки культуры Б в результате катаболитной репрессии глюкозой содержат значительно меньше р-галактозидазы, чем клетки культуры А.

Количество биомассы используемых клеток удобно определять по калибровочной кривой, отражающей зависимость между оптической плотностью при 420 нм (определяемой с помощью колориметра) суспензии клеток в 0,05 М натрий-фосфатном буфере. рН 7,2, и сухим весом бактерий. Культуры должны быть разбавлены соответствующим образом, так чтобы зависимость между оптической плотностью и сухим весом была линейной (разд. 25.2.2). В описываемых ниже экспериментах в качестве относительной меры при измерении биомассы можно использовать единицы оптической плотности при условии, что измерения проводятся при таких концентрациях клеток, когда зависимость между оптической плотностью и количеством биомассы имеет линейный характер.

Клетки в культурах А и Б собирают центрифугированием, промывают один раз 0,05 М натрий-фосфатным буфером, рН 7,2, и ресуспендируют в том же буфере. Отбирают пробы и соответствующим образом разводят их, чтобы определить количество биомассы (например, по оптической плотности при 420 нм или в микрограммах сухих клеток в 1 мл) в единице объема. Затем клетки обрабатывают толуолом, как описано ниже (разд. 18.2.8), после чего их можно использовать в последующих процедурах по стандартизации.

Зависимость активности фермента от времени

Готовят 10—20 проб реакционной смеси, содержащих достаточное количество клеток (обычно его определяют в предварительных опытах с различными концентрациями клеток). Реакцию начинают добавлением о-нитрофенил-р-О-галактопиранозида, а останавливают с помощью ЫагСОз, который вносят через 0, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 15, 20, 25 и 30 мин. Снимают показания оптической плотности при А420 и определяют время, в течение которого скорость реакции остается линейной. Выбирают удобное для эксперимента время (например, 15 мин) в пределах линейного участка кривой и пользуются им в последующих экспериментах.

Зависимость активности фермента от количества биомассы

Готовят еще одну серию разведений реакционной смеси, содержание клеток в которых увеличивается от нуля до относительно высокого уровня. При повышенном содержании клеток дополнительную мутность суспензии при 420 нм следует учитывать путем сравнения с контрольными пробами. Контрольные пробы по составу идентичны опытным, но в них отсутствует о-нит-рофенил-р-Э-галактопиранозид. Значения А420 контроль

ных проб вычитают из соответствующих значений опытных проб. Все реакции заканчивают в заранее определенное время (например, через 15 мин). Затем вычисляют активность фермента и откладывают ее значения в виде функции количества биомассы в реакционной смеси, как показано на рис. 18.1. Результаты, полученные при работе с данным ферментом, можно считать

ферментативной активности от количества биомассы.

пределах линейного участка рассмотренной выше кривой.

Эти же процедуры по стандартизации следует провести с клетками культуры Б. После расчета ферментативной активности, приходящейся на единицу биомассы (1 мг или 1 мкг сухого веса или одна единица оптической плотности при 420 нм), и сравнения полученных результатов с результатами для клеток культуры А определяют удельную активность фермента, присутствующего в каждой культуре. Клетки культуры Б, подвергавшиеся катаболитной репрессии, имеют более низкую по сравнению с клетками культуры А активность р-галактозидазы на единицу биомассы.

18.2.3. Общие методики

Мы не можем описать здесь подробно все многочисленные способы определения различных ферментов. Достаточно сказать, что анализ может быть непрерывным, когда за реакцией наблюдают, не нарушая ее хода, или периодическим, т. е. связанным с периодическим отбором проб для измерения потребления субстрата или образования продукта. Например, фумаразу можно определять с помощью непрерывного анализа, применяя прямое спектрофотометрическое измерение или метод сопряжения с другой ферментативной системой (анализ глутаминсинтетазы последним методом см. в разд. 18.2.11). Предпочтительнее, однако, применять методе периодическим отбором проб. Его осуществляют с помощью самых разнообразных способов, включая спект-рофотометрический, манометрический, полярометриче-ский и хроматографический. Проводят измерения также с помощью электродов и с использованием широкого набора химических агентов и изотопов (гл. 16).

С некоторыми из этих способов можно познакомиться на примере восьми описанных ниже методик, в которых определяют активность ферментов каждого из шести классов: оксидоредуктаз, трансфераз, гидролаз, ли-аз, изомераз и лигаз. Ферменты каждого класса участвуют в регуляторных процессах метаболизма. Методы изучения регуляции ферментативной активности и синтеза ферментов рассматриваются ниже в этой же главе. Все ферменты, активность которых определяют в приведенных здесь методиках, встречаются в клетках широко распространенных диких штаммов Е. coll, например в клетках штамма Крукса (АТСС 8739), штамма W (АТСС 9637) или штамма К-12 (АТСС 14948).

18.2.4. Оксидоредуктазы (нитратредуктаза)

Нитратредуктаза (цитохром) (КФ 1.9.6.1, ферроци-тохром: нитрат оксидоредуктаза) катализирует следующую окислительно-восстановительную реакцию:

Ферроцитохром + Нитрат > Феррицитохром + Нитрит.

Такая нитратредуктаза является связанным с мембраной ферментом

страница 70
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84

Скачать книгу "Методы общей бактериологии. Том 2" (4.15Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(16.06.2019)