Биологический каталог




Методы общей бактериологии. Том 2

Автор Ф.Герхардт

cientific Co.). Окись алюминия промывают и высушивают при 100°С. Замороженный (или охлажденный) осадок клеток помещают в охлажденную ступку. Соотношение охлажденной окиси алюминия и клеточной массы — 1:2 (по весу). Энергично растирают смесь 2—5 мин. За это время порошкообразная смесь превращается в липкую, клееобразную массу, что свидетельствует о разрушении клеток. Добавляют соответствующий буфер, ресуспендируют содержимое ступки и центрифугируют его для удаления окиси алюминия и неразрушенных клеток. Этим способом можно быстро разрушить относительно большое количество клеток. Большинство бактерий, однако, эффективнее разрушается другими методами.

Пресс Хьюза. Намного более эффективный способ разрушения бактерий описан Хьюзом и др. [22]. Он основан на сдвиговых усилиях, возникающих под действием кристаллов льда внутри клеток или абразивного порошка на поверхности клеток. Пресс Хьюза состоит из устройства для пропускания замороженной клеточной суспензии или пасты из клеток (с добавлением абразивного материала, например равного объема пирексового стеклянного порошка, или без него) через небольшое отверстие в приемную камеру. Суспензию пропускают под высоким давлением (6,8-107—54,4-107 Па), создаваемым гидравлическим прессом. Существует несколько модификаций исходного пресса Хьюза.

Пресс охлаждают в морозильнике или с помощью сухого льда от —25 до — 30 °С. В камеру помещают суспензию или замороженный осадок клеток. Устанавливают поршень над суспензией и подают давление до тех пор, пока она не пройдет через маленькое отверстие в приемник.

Разрушение клеток в замороженном виде с помощью пресса Хьюза — один из наиболее эффективных способов разрушения клеточного материала разного происхождения: о г бактериофагов до животных тканей. С его помощью можно разрушать клетки бактерий, обычно трудно поддающиеся разрушению (например, грамположительных кокков).

В общем наиболее распространенные физические методы разрушения клеток можно классифицировать следующим образом в порядке уменьшения их дезинтегрирующего действия: пресс Хьюза >- вибрационные мельницы> пресс Френча ;> ультразвуке растирание с окисью алюминия. По устойчивости к разрушению клетки различных микроорганизмов можно расположить в последовательности (в порядке уменьшения): дрожжи> >мицелий грибов>грамположительные кокки>грам-положительные палочки >грамотрицательные палочки >галобактерии>-микоплазмы.

Способ разрушения клеток выбирают в основном эмпирически в зависимости от вида клеток, нужного объема экстракта, чувствительности фермента (ов) к инактивации или изменению в процессе разрушения и необходимости последующего хранения. Часто это приходится делать методом проб и ошибок.

18.2. ИЗМЕРЕНИЕ АКТИВНОСТИ

18.2.1. Общие замечания

Метод определения активности фермента должен быть по возможности точным, чувствительным, непрерывным, удобным и специфическим для изучаемой реакции. Однако чаще всего выполняются далеко не все эти требования. Поэтому, прежде чем признать метод пригодным для использования, необходимо провести многочисленные контрольные и стандартные тесты. Ниже приведено краткое описание этих тестов.

Изменяющиеся условия эксперимента

В большинстве случаев для определения активности ферментов каждого определенного вида организма нужны специальные условия. Нельзя применять один и тот же метод для изучения ферментов одного типа у различных видов бактерий. От вида к виду могут сильно различаться потребности бактерий в ионах и кофакторах, оптимумы рН и температуры, значения Км, чувствительности к ингибиторам и равновесия реакций. Классический пример такого типа вариаций — бактериальная сукцинатдегидрогеназа: условия определения активности этого фермента настолько варьируют, что авторы часто не указывают состав реакционной смеси [35].

Подавление активности

Если в неочищенном экстракте ферментативная активность не обнаруживается, это еще не означает, что организм, из которого приготовлен экстракт, не содержит этот фермент. Частичная или полная потеря активности фермента, присущей данному микроорганизму, может произойти во время приготовления экстракта. Внутри клетки фермент защищен от инактивации оксидантами и другими веществами окружающей средой и многочисленными белок-белковыми взаимодействиями, которые нарушаются в результате разрушения клеток. В связи с этим следует отметить, что содержание белка в большинстве клеток превышает 100 мг/мл [28]. Однако чаще всего в анализах in vitro используют разбавленные водные растворы ферментов, так как в этих условиях легче осуществлять контроль в процессе эксперимента.

Особенно важно учитывать влияние концентрации белка на активность фермента при изучении регулятор-ных ферментов [28].

Если предполагают, что причиной инактивации фермента является его чувствительность к кислороду, перед разрушением клеток в среду добавляют антиоксиданты, такие, как восстановленный глутатион, fj-меркаптоэта-нол или дитиотрейтол. Можно также проводить разрушение клеток и все последующие процедуры в анаэробной камере. Анаэробная камера дорого стоит, и работа в ней связана с определенными неудобствами, однако в некоторых лабораториях для предотвращения инактивации ферментов успешно применяют именно этот способ. Чтобы уменьшить инактивацию, вызываемую двухвалентными ионами, часто в клеточные экстракты добавляют хелатобразующие агенты, например ЭДТА. Поскольку многие ферменты in vitro чувствительны к инактивации теплом, экстракты клеток обычно готовят и хранят при температуре 0—4°С. Однако некоторые ферменты инактивируются при низкой температуре и при 0—4°С быстро теряют активность.

Если не удается обнаружить активность фермента, который, по-видимому, присутствует в неочищенном экстракте, это может объясняться рядом причин. Во-первых, предположение о присутствии фермента может быть ошибочным. Во-вторых, фермент может присутствовать в экстракте, но не проявлять активность, пока в реакционную смесь не будут внесены недостающие компоненты или из нее не будут удалены ингибиторы его активности. Причины такого рода уже обсуждались выше, а некоторые другие факторы рассматриваются в большинстве работ, указанных в списке литературы по этой теме.

Помимо всего прочего, рекомендуется проводить контрольный эксперимент, добавляя к исследуемой смеси экстракт клеток, заведомо содержащий интересующий фермент \50]. Если в условиях проводимого эксперимента контрольный фермент проявляет активность, можно с уверенностью (хотя и неполной) считать, что экстракт содержит все необходимые компоненты и не содержит ингибиторов. Но даже после проведения такого контроля и выявления активности добавленного фермента полной уверенности в отсутствии исходной активности нет. Ее отсутствие может быть обусловлено множеством непредсказуемых факторов. Например, не исключено, что фермент присутствует в экстракте в неактивной форме. Известно также о существовании реакций, в результате которых фермент становится неактивным из-за ковалентных изменений в его белковой части (разд. 18.3.4).

Конкурентные побочные реакции и сопряженный анализ

Определению ферментативной активности могут мешать конкурентные побочные реакции. Концентрации субстратов или образующихся веществ могут настолько сильно меняться в результате таких конкурентных реакций, что точное измерение активности становится невозможным.

Например, активность NADH-оксидазы или аде-иозинтрифосфатазы в неочищенных экстрактах может быть такой высокой, что определение образования или потребления NADH или АТР соответственно будет вызывать большие трудности. Необходимо либо учитывать побочные реакции путем соответствующего контроля, либо находить способы их подавления или нарушения.

Вместе с тем конкурентные реакции используются при разработке методик сопряженного анализа. Такие методики предусматривают взаимодействие исходного фермента (активность которого измеряют) с одним или двумя вспомогательными ферментами, внесенными в реакционную смесь:

заа

Исходный фермент Вспомогательный фермент

в ^ с,

Исходный фермент Вспомогательный фермен^

А >- В *- С

Вспомогательный фермента

>- D

Применение сопряженного анализа, а также некоторые способы регулирования конкурентных побочных реакций можно проиллюстрировать на примере описанной Вудом [50] методики общего определения киназ. Она применима также ко многим другим субстратам, включая глюконовую и 2-кетоглюконовую кислоты, пен-тозы и полиолы, а также гексозы.

Методика основана на взаимодействии ADP, образованного в результате реакции, катализируемой АТР-киназой (исходного фермента), с пируваткиназой и лак-татдегидрогеназой (два вспомогательных фермента):

ROH + ATP ROP -f ADP;

Пируваткиназа

ADP -f- Фосфоенолпируват >• A-TP -f~ Пируват:

Лактатдегидрогеиаза

Пируват -f- NADH *~ Лактат -f NAD.

Как было установлено, скорость реакции, катализируемой исходным ферментом, является фактором, ограничивающим скорость общей реакции; ее определяют путем непрерывного измерения изменяющейся со временем оптической плотности при 340 нм и выражают в микромолях в 1 мин, зная коэффициент экстинкции (6,22-flO6 см2/моль) и объем реакционной смеси. Затем вычисляют удельную активность в микромолях субстрата, фосфорилируемого в 1 мин, на 1 мг белка.

Применение повторного синтеза АТР в этой системе дает явное преимущество, заключающееся в возможности использования малых количеств АТР, что позволяет снизить участие АТР в побочных реакциях и одновременно уменьшить возможное ингибирование киназы аде-нозинтрифосфатом. Концентрация АТР остается почти постоянной. Применяя регистрирующий спектрофотометр, получают более надежные данные, чем в случае однократного определения активности в каждой точке.

Для анализа готовят следующие реактивы: 0,7 М трис-HCl, рН 7,5; 0,1 М MgCl2; 0,05 М Na2-ATP; 0,05 М тринатрий- или трициклогексиламмонийфосфоенолпиру-ват; 0,15М глутатионнатрия (восстановленный); 0,005М Na2-NADH; 0,15 М лактатдегидрогеназа; 0,15 М пиру-ваткиназа и 0,15 М субстрат. В микрокювету (1,25Х X 1,25X2,5 см, объем 0,5 мл; Pyrocell Manufacturing

страница 69
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84

Скачать книгу "Методы общей бактериологии. Том 2" (4.15Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(24.08.2019)