шно применена для того, чтобы сделать их проницаемыми и, следовательно, чувствительными к актиномицину D [26]. Рекомендуется [42] шире применять такую обработку при изучении сложных систем, таких, как ферменты, связанные с мембранами, и ферменты взаимопревращения. Более того, везде, где это возможно, следует сравнивать ферментативные активности обработанных и интактных клеток.

18.1.3. Препараты дезинтегрированных клеток

Во многих случаях целые клетки, как проницаемые, так и непроницаемые, бывают непригодны или слишком сложны для исследований, и тогда приходится прибегать к дезинтегрированным клеточным препаратам.

Впервые работа с использованием таких препаратов в качестве источника ферментов была опубликована в 1897 г. Бюхнером. Эксперименты Бюхнера называют «одними из основополагающих экспериментов в современной биохимии, стоящими в одном ряду с опытами Лавуазье в химии» [22].

Методы дезинтеграции бактериальных клеток уже обсуждались в настоящем руководстве в связи с выде лением клеточных структур (разд. 5.1)

Разрушение клеток под действием осмотических сил

Бактериальные клетки разрушают различными способами. Пожалуй, самым мягким из всех механических способов разрушения клеток является разрушение клеточной мембраны под действием гидростатического (осмотического) давления. Для большинства бактерий этот метод неприменим, если не обрабатывать предварительно клеточные стенки ферментами или не изменять их структуру другими способами.

Применение осмотического шока оказалось очень полезным при изучении некоторых ферментов грамотрицательных бактерий. Эти ферменты локализуются между плазматической мембраной и наружными слоями клеточной стенки в периплазматическом пространстве, и поэтому их называют «периплазматическими» ферментами [32, 33]. Обычно это гидролазы, такие, как щелочная фосфатаза, рибонуклеаза I и циклическая фосфоди-эстераза. Метод выделения этих Ферментов из клеток Е. coli описан Хьюзом и др. Г22]. Он включает следующие этапы: 1) тщательное промывание клеток свежей средой или соответствующими буферами; 2) суспенди-рование промытого осадка клеток в растворе 0,5 М сахарозы (80 частей); 3) цeнтpифvгиpoвaниe и декантирование надосадочной фракции; 4) быстрое диспергирование осадка путем сильного встряхивания в холодном 5-Ю-4 М растворе MgCl2 (80 частей); 5) центрифугирование и изучение надосадочной фракции с целью выявления периплазматических ферментов.

Обработка смесью лизоцим — ЭДТА также является прекрасным способом быстрого и мягкого лизиса грамотрицательных клеток. Ее проводят при низкой или комнатной температуре. В осмотически щадящей среде (для того, чтобы не произошло полного разрушения клеток) при этом образуются сферопласты. Таким способом можно одновременно обрабатывать до 30 л клеток. С помощью этой мягкой обработки можно выделить всю фракцию полирибосом. Для оптимального разрушения клеток бактерий различных видов используют разные концентрации растворов буфера, ЭДТА и лизо-цима. Приведенная ниже методика первоначально была описана Репаске [37] для разрушения клеток Е. coll. Промытые клетки суспендируют в 3 мл смеси, содержащей 100 М трис-HCl, рН 8,0, 0,8 мг ЭДТА, рН 7,5, 50 мкг лизоцима и воду. Лизис начинается после добавления лизоцима; его можно проводить при комнатной температуре в течение 5 мин или же на холоду.

Мягкая осмотическая обработка применяется также при выделении протопластов и мембранных везикул грамположительных бактерий. Выделенные с ее помощью препараты чрезвычайно полезны при изучении транспорта веществ через бактериальную мембрану. Способы их получения обсуждаются и описываются в следующей главе (разд. 19.3).

Дезинтеграция

Опубликованы обзоры по различным физическим и химическим методам дезинтеграции бактериальных клеток [б, 22]. В них, особенно во втором, читатель найдет более подробную информацию, касающуюся применения этих методов. Из всех имеющихся средств эффективными для разрушения клеток бактерий (и дрожжей) являются пресс Френча или подобные ему устройства, вибрационные мельницы, ультразвуковые дезинтеграторы, некоторые ручные мельницы и пресс Хьюза. Большинство других устройств предназначено для специальных целей или же эффективно при обработке организмов, которые разрушаются легче, чем бактерии (например, ткани простейших или ткани животных). Наиболее полезный и эффективный химический способ дезинтеграции клеток включает использование литических агентов (таких, как лизоцим или лизоцим в сочетании с хелатобразующими агентами, например ЭДТА). Ниже кратко описаны наиболее подходящие приборы, используемые в настоящее время для разрушения клеток в бактериальной энзимологии.

Пресс Френча. Пресс Френча — очень эффективное устройство для разрушения клеток многих видов микроорганизмов. В продаже имеется много вариантов этого устройства. Простейшее из них состоит из камеры, помещенной в лабораторный гидравлический пресс, способный создавать общее давление 10—20 т. В камеру вносят клеточную суспензию, которую подвергают действию поршня. Клетки эффективно разрушаются при выходе суспензии под давлением из маленького отверстия камеры. Одной рукой можно регулировать давление гидравлического пресса, а другой скорость выталкивания клеток через игольчатый клапан. В продаже имеется устройство с автоматическим гидравлическим прессом (American Instrument Co., Silver Spring, MdL), а также усовершенствованный вариант этого устройства (Sorvall — Ribi Fractionator, Ivan Sorvall Inc., Norwalk, Conn.).

Предварительно охлажденный пресс Френча заполняют суспензией клеток. Поршень заранее устанавливают таким образом, чтобы объем камеры был равен 5, 10, 20 или 50 мл. Систему устанавливают (с поршнем в нижнем положении) на специальный штатив, добавляют немного избыточного количества суспензии клеток и открывают игольчатый клапан, чтобы при закрывании крышки камеры избыточная жидкость выливалась через отверстие. (Это обеспечивает вытеснение воздуха из камеры и предотвращает выход сжатого воздуха вместе с последней порцией суспензии.) Закрывают игольчатый клапан и собранный аппарат помещают (с поршнем в нижнем положении) на гидравлический пресс. Подают давление 6,8-107—20,4-107 Па и поддерживают его на постоянном уровне во время медленного просачивания суспензии через соединенную с отверстием трубку в соответствующий охлажденный приемник.

Этим методом можно разрушать большинство бактерий, даже те, которые разрушаются особенно трудно, например микобактерии. Суспензию грамотрицательных

Кокков часто требуется пропускать через пресс повторно. Помимо того что этот способ разрушения очень удобен и эффективен, он имеет еще одно достоинство: при его использовании инактивация ферментов минимальна. Рекомендуется использовать относительно густые суспензии клеток: около 0,5 г клеток (сырого веса) или больше в 1 мл [22]. В густых суспензиях разрушение клеток происходит лучше, а инактивация ферментов меньше, чем в разбавленных.

Вибрационные мельницы. Наиболее часто используются вибрационные мельницы марки Mickle (Mickle Ltd., Mill Works, Yomshall, Surrey, England) и Nossal (McDonald Engineering Co., Bay Village, Ohio). Недорогую вибрационную мельницу для небольших объемов клеток можно изготовить с помощью зубного амальгаматора (например, модель LP-60, Crescent Co., Lyons 111.). К суспензии клеток добавляют мелкие стеклянные шарики (Superbrite glass beads, grade 110, Minnesota Mining and Manufacturing Ca., Minneapolis Minn, или Ballotini Beads, English Glass Co., Ltd., Leicester, England) и смесь помещают в стеклянную или металлическую капсулу, поставляемую фирмой-изготовителем. Для оптимального разрушения эмпирически подбирают соотношение объемов шариков и клеток, которое обычно равно 1:1. Объемы смеси, как правило, не превышают 25 мл. Для обработки с помощью мельницы Mickle требуется длительное встряхивание. Меньшее время затрачивается при работе с мельницей Nossal с повышенной вибрацией. Во время встряхивания образуется тепло, поэтому применяют какую-либо охлаждающую систему. Для охлаждения мельницы Nossal, например, используют систему с СОгОбработка ультразвуком. Разрушение клеток ультразвуком обусловлено кавитационными силами, создающими ударные волны или кавитационный микропоток, что способствует химической атаке свободными радикалами. Каким бы ни был механизм дезинтеграции, ультразвуковая обработка — очень эффективное средство разрушения бактериальных клеток. В продаже имеются различные ультразвуковые дезинтеграторы.

Хотя можно обрабатывать и относительно густые суспензии клеток, эффективность разрушения в вязких растворах значительно снижается. По мере выхода крупных молекул, например ДНК, суспензия становится более вязкой и разрушение клеток ухудшается. Более разбавленные клеточные суспензии быстрее разрушаются ультразвуком. Время обработки обычно определяют эмпирически, учитывая необходимость отвода выделяющегося тепла, а также чувствительность ферментов к инактивации.

Клеточную суспензию охлаждают, помещая сосуд, в котором она находится, в лед или смесь льда с солью, или же холодной водой, циркулирующей между двойными стенками сосуда. Кончик датчика прибора опускают на несколько миллиметров ниже поверхности жидкости. Затем устанавливают генератор на рекомендуемую мощность и настраивают прибор на нужную частоту (резкий шипящий звук соответствует наиболее эффективному разрушению клеток). После необходимого периода обработки изменяют подаваемую частоту и выключают прибор. Для заглушения шума, издаваемого прибором, рекомендуется создать акустическую защиту вокруг датчика.

По-видимому, ультразвуковая обработка — наиболее быстрый и легкий способ разрушения клеток. Еще одно его достоинство заключается в том, что с его помощью эффективно разрушаются самые различные бактерии. Все это позволяет широко применять этот способ в бактериологических исследованиях.

Растирание клеток с окисью алюминия. Это один из наиболее дешевых способов разрушения бактерий. Для него необходимы лишь ступка, пестик и порошок окиси алюминия (например Polishing Alumina, grade А-301, Fischer S