Биологический каталог




Методы общей бактериологии. Том 2

Автор Ф.Герхардт

ользуются в энзимологических исследованиях, благодаря чему мы можем сегодня обнаруживать и количественно определять сотни ферментов как в эукариотических, так и в прокариотических клетках. В некоторых случаях возможно обнаружение в клетке всего нескольких молекул фермента и измерение скоростей реакций, протекающих за микросекунды. Пожалуй, изучение отдельных ферментов и ферментных систем больше, чем какие-либо другие биохимические исследования, способствовали лучшему пониманию фундаментальных биоэнергетических и биосинтетических процессов, лежащих в основе всего живого.

Бактериальные системы играют ключевую роль почти на всех этапах энзимологического исследования, и современный бактериолог обязательно должен обладать знаниями в области теоретической и практической энзи-мологии. Это справедливо независимо от того, чем именно интересуется данный исследователь: вопросами общего характера или вопросами, связанными с медициной, сельским хозяйством, промышленностью и т. п.

Сознавая это, следует также согласиться с тем, что знания в области энзимологии нельзя получить с помощью одного лишь экскурса в предмет. Данная глава преследует две цели: во-первых, дать читателю общее целостное представление о практическом аспекте изучения ферментных систем бактерий и, во-вторых, рассмотреть некоторые специальные лабораторные методы, с помощью которых можно изучать функционирование, образование и регуляцию бактериальных ферментов.

В разд. 18.1 рассматриваются различные типы клеточных препаратов, обычно используемых в энзимологи-ческих исследованиях, после чего следует описание того, как измеряется активность ферментов вообще и ферментов шести основных классов в частности (разд. 18.2). С помощью ферментов можно изучать различные процессы регуляции, связанные с изменениями их активности: в разд. 18.3 рассматриваются эти процессы в целом, а также два основных типа регуляции — аллосте-рический и путем ковалентной модификации. Присутствие и отсутствие тех или иных ферментов у определенной бактерии зависит, разумеется, от ее генотипа. Но даже если у бактерии имеются определенные гены, их транскрипция и трансляция с образованием соответствующих молекул фермента могут и не происходить. Здесь следует учитывать факторы, участвующие в регуляции генетической экспрессии и, следовательно, синтеза ферментов, рассмотренные в разд. 18.4. И наконец, поскольку ферментативные реакции редко протекают в бактериальных клетках как изолированные процессы и чаще всего являются частью сложной сети метаболических путей и циклов с взаимозависимыми этапами, мы сочли нужным рассмотреть здесь некоторые общие и специальные методы анализа путей метаболизма (разд. 18.5).

В настоящее время существует много различных методов изучения метаболизма бактерий, рассмотрение которых следовало бы включить в эту главу. Здесь было бы полезно, например, обсудить методы, применяемые для идентификации и количественного определения различных ферментов дыхательной цепи, участвующих в образовании взаимосвязанных путей, через которые идет поток электронов и образуются хемиосмотические градиенты. Интересно было бы рассмотреть также общие методы анализа специфических катаболических и анаболических процессов. К сожалению, объем данной книги не позволяет включить описание этих и многих других методов.

В данной главе используются следующие общепринятые сокращения: сАМР — циклический аденозин-З^б'-монофосфат; AMP, ADP и АТР — аденозинмоно-, аде-нозинди- и аденозинтрифосфат соответственно; Ф-б-Р — фруктозо-6-фосфат; ФДФ — фруктозо-1,6-дифосфат; Г-6-Р — глюкозо-6-фосфат; GDP и GTP — гуанозинди-и гуанозинтрифосфат соответственно; ЭДТА — этилен-диаминтетраацетат; NAD и NADH — окисленный и восстановленный никотинамидадепиндииуклеотид соответственно; NADPH — восстановленный никотинамидаде-ниндинуклеотидфосфат; трис — трис- (гидроксиметил) -аминометан.

18.1. ПОДГОТОВКА КЛЕТОК

Конечной целью изучения ферментных систем бактерий является получение исчерпывающей информации о различных реакциях, протекающих в клетках, которая позволила бы понять, как эти реакции вплетены в ткань жизненных процессов. В идеале такие исследования должны проводиться на растущих клетках с интактной структурой и ненарушенным метаболизмом. Во многих случаях это удается осуществить, однако чаще всего приходится использовать менее идеальный источник получения клеточных компонентов.

Прежде всего исследователь должен решить, какой тип препарата больше всего соответствует целям эксперимента. И, хотя уже проведено огромное количество экспериментов на сотнях различных штаммов бактерий, очень трудно сформулировать какие-либо определенные рекомендации относительно выбора «наилучшего» метода. Здесь применимо только правило оптимального выбора: использовать препараты дезинтегрированных клеток в тех случаях, когда их невозможно сделать проницаемыми, и делать клетки проницаемыми, если нет возможности работать с интактными покоящимися или растущими клетками.

18.1.1. Интактные клетки

Растущие клетки

Все основные жизненные процессы, протекающие Е активно растущих бактериях, включая размножение, имеют высокоорганизованный и строго регулируемый характер и во многих отношениях представляют собой идеальную систему для исследования ферментов. Во время роста клеток все их метаболические системы находятся в подвижном равновесии: питательные вещества и ионы поступают в клетки, а конечные продукты метаболизма выводятся. Во всех случаях, когда это возможно, желательно использовать интактные растущие клетки.

Покоящиеся клетки

Рост клеток можно остановить, если отделить их (путем центрифугирования или фильтрации) от питательной среды и суспендировать в «нейтральной», осмотически подходящей среде, например забуференном физиологическом растворе или минерально-солевой среде, лишенной источников углерода и азота (разд. 25.1). Обработанные таким образом клетки называются покоящимися. Они обладают тем же набором ферментов, что и растущие клетки, но находятся в относительно неактивном состоянии. На таких клетках можно изучать реакции или группы реакций, представляющие особый интерес. Например, можно определять поток электронов, идущий от субстратов, таких, как D-лактат или сукцинат, через систему дыхания в условиях, когда рост и метаболические требования минимальны. Покоящиеся клетки некоторых видов способны синтезировать белки, и их часто используют для изучения этого процесса. Кроме того, покоящиеся клетки служат объектом при изучении транспортных процессов, включая транслокацию субстратов и ионов. С этой целью отмытые клетки обычно суспендируют в осмотически пригодной среде, содержащей для подавления синтеза белка хлорамфе-никол (50—100 мкг/мл). При проведении некоторых экспериментов, например связанных с изучением транспорта, часто рекомендуется использование эндогенных источников энергии (разд. 19.2).

Голодающие покоящиеся клетки

Бывают случаи, когда клетки полностью лишают эндогенных источников энергии. Прекрасный пример использования голодающих покоящихся клеток — измерение внутриклеточного АТР, образующегося за счет хе-миосмотического мембранного потенциала. В неголодающих клетках выявление АТР, синтезированного за счет хемиосмотического градиента [49], затруднительно из-за высокого фонового уровня АТР. Методика голодания для Е. coli была разработана Кохом [25]. При ее использовании клетки Е. coli быстро утилизируют резервные питательные вещества в циклическом процессе фосфор илирования/дефосфорилироваиия а-метилглюко-зида, который у этих бактерий фосфорилируется при участии фосфоенолпируват-фосфотрансферазной системы. Клетки собирают центрифугированием при 4°С и промывают основной средой или 0,12 М трис-НС1, рН 8,0. Затем их суспендируют до плотности 5 мг клеток (сухого веса) на I мл основной среды, содержащей 20 мМ а-метилглюкозида и 40 мМ азида натрия, и инкубируют при 37 °С от 45 до 120 мин в зависимости от используемого штамма. После этого клетки снова центрифугируют, промывают и ресуспендируют в соответствующем растворе (разд. 25.1).

Более обычный способ подавления эндогенного метаболизма, по крайней мере у аэробов или факультативных аэробов, заключается просто в энергичном аэрировании густой суспензии клеток (в основной среде или буфере) в течение 2—4 ч или дольше, если это необходимо. За сокращением запасов питательных веществ в клетках можно следить, измеряя максимальное снижение эндогенного дыхания Q (О2) относительно уровня Q (Ог), необходимого для окисления какого-либо субстрата, например глюкозы.

18.1.2. Проницаемость клеток

Работа с интактными клетками имеет свои трудности. Главная трудность заключается в том, что как растущие, так и покоящиеся клетки непроницаемы для большинства субстратов, кофакторов и метаболитов, обычно используемых при определении ферментов. Принято считать, что лучше всего изучать ферментативные реакции в условиях, когда белок-белковые (или белок-мембранные) взаимодействия между молекулами одного фермента (гомологичные взаимодействия) или между молекулой данного фермента и молекулой другого белка (гетерологичные взаимодействия) подобны тем, которые существуют in situ [42]. Хотя при использовании интактных клеток данное условие выполняется, это малоутешительно, если необходимые субстраты не могут проникать через клеточную мембрану.

Обработка растворителями

Существует ряд методик, позволяющих более или менее успешно Делать целые клетки более проницаемыми и тем самым использовать их для исследования ферментов. Например, при обработке клеток Е. coli растворителями (толуолом или бензолом) они становятся проницаемыми для р-галактозидов, которые проникают в клетки и подвергается гидролизу р-галактозидазой [4]. Растворители применяются также при определении фос-фоенолпируват-фосфотрансферазной системы у Е, coli [17]. Для обработки клеток используются также различные растворы толуола в этаноле. Иногда такая обработка сопровождается замораживанием и оттаиванием клеток [6].

Обработка хелатообразующими агентами

Обработка энтеробактерий хелатобразующим агентом (трис-ЭДТА) была успе

страница 67
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84

Скачать книгу "Методы общей бактериологии. Том 2" (4.15Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(16.06.2019)