Биологический каталог




Методы общей бактериологии. Том 2

Автор Ф.Герхардт

помехи, вызываемые небиологическим восстановлением ацетилена. При более длительном воздействии эти помехи можно уменьшить путем правильной постановки контроля. Хотя никакая другая система быстрого восстановления ацетилена, кроме нитрогеназы, неизвестна, важно проверить ее наличие путем подавления реакции аммиаком [96].

Поскольку азотфиксация осуществляется как аэробными, так и анаэробными бактериями, схема эксперимента может быть различной [96]. Большое значение имеют правильные условия инкубации, включая освещение и температуру. Определение активности нитрогеназы для систематики бактерий рассматривается в разд. 20.2.7, где продолжено обсуждение этого вопроса 1К

Оборудование и реактивы

Газовый хроматограф с пламенно-ионизационным детектором и соответствующей колонкой для определения ацетилена и этилена.

Пластмассовые шприцы и соответствующие иглы.

Шприц с тефлоновым поршнем, открывающийся для отбора пробы газа и закрывающийся для удержания в нем пробы.

Высокоочищенный поставляемый фирмами ацетилен в инертном газе (1—4%, по объему). (Предупреждение! Баллон с газом должен быгь фиксирован у стола. Редуктор должен соответствовать баллону.)

!) В отдельных случаях методика с восстановлением ацетилена для определения нитрогеназы неприменима, например в присутствии метана, который утилизируют некоторые бактерии. — Прим. ред.

Методика

Чистые или накопительные культуры выращивают в колбах или пробирках со средой, не содержащей азота. Наилучшие результаты получают с аэробными культурами, которые имеют лишь слабую мутность. Объем газа над средой в колбе или пробирке должен превышать объем жидкости в 5—10 раз. До добавления ацетилена сосуды следует герметически закрывать. Ацетилен добавляют до конечного давления 0,05—0,10 атм, что эквивалентно насыщению нитрогеназы при 0,8 атм N2 [85].

Состав остальных компонентов газовой фазы зависит от типа исследуемых бактерий (аэробного или анаэробного). Для стандартизации вводимого ацетилена и обнаружения иебиологического восстановления ацетилена аналогичные операции проводят со стерильными средами или со средами, содержащими клетки, убитые формальдегидом. Отбираемые из них пробы тестируют на ацетилен и этилен немедленно после инкубационного периода.

Этилен определяют с помощью газового хроматографа после нескольких часов инкубации при соответствующих освещении и температуре (для чистых культур обычно достаточно 3 ч) в отбираемых из газовой фазы пробах (50 мкл). Времена удерживания для ацетилена и этилена устанавливают либо согласно инструкции фирмы-изготовителя или поставщика материала насадки, либо с помощью стандартов ацетилена и этилена. Количество образующегося этилена определяют по высоте пика (учитывая настройку диапазона и регулятора чувствительности хроматографа) в сравнении со стандартом. Оно должно быть равно количеству восстановленного ацетилена, если установлено, что образующийся этилен не является естественным побочным продуктом метаболизма исследуемых микроорганизмов. Для определения количества молей фиксированного N2 следует разделить число молей восстановленного С2Н2 на 3— результат будет соответствовать потребности в электронах для образования из N2 аммиака.

Применение методики

Эту методику применяют для чистых или накопительных культур азотфиксирующих микроорганизмов. Описана также модификация этой методики для ферментных препаратов Г96].

17.6.11. Специфические азотсодержащие соединения

Специфический качественный и количественный анализ азотсодержащих соединений, таких, как пептиды, нуклеиновые кислоты, пестициды и загрязняющие вещества, можно осуществлять с помощью масс-спектромет-рии. Достоинствами этого метода являются его специфичность, возможность обнаружения малых количеств вещества и использования небольшого количества пробы (микрограммов или микролитров), а также возможность определения вещества в любом состоянии — газообразном, жидком и твердом. Основной его недостаток заключается в том, что для него необходимо специальное оборудование, а обработка полученных данных имеет свои трудности. Теория и применение масс-спектрометрии подробно описаны в ряде работ '[69, 72, 74].

17.7. ОРГАНИЧЕСКИЕ КИСЛОТЫ И СПИРТЫ

Органические кислоты и спирты с короткими цепями образуются в бактериях в качестве промежуточных или конечных продуктов цикла лимонной кислоты, гликолиза и других путей метаболизма. Эти соединения накапливаются в цитоплазме или выделяются в среду. В клетках бактерий они обнаруживаются в низкомолекулярной надосадочной фракции после осаждения макромолекул охлажденной ТХУ (рис. 17.1 в разд. 17.1). Эта фракция включает ацетат, ацетоацетат, р-оксибути-пат, цитрат-изоцитрат, сс-кетоглутарат, формиат, лактат, сукцинат, пируват, малат, фумарат, этанол и многие другие вещества.

Низкомолекулярные вещества анализируют с помощью ионообменной (разд. 16.3.1), абсорбционной (разд. 18.5.2) или — что лучше всего — газожидкостной распределительной хроматографии (разд. 16.3.4). Лак-тат можно также анализировать ферментативным или колориметрическим методом (разд. 17.2.8).

17.8. ЭЛЕМЕНТЫ

Содержание различных элементов в бактериальных клетках и биологическая роль микроэлементов обсуждаются в работах [107, 109]; приготовление и хранение проб для анализа различных элементов описано в работах [107, 111]. Содержание металлов в пробах, представляющих интерес для бактериологов, определяют с помощью колориметрических методов, метода атомной абсорбции, фотометрии, спектрофотометрии, пламенно-эмиссионной фотометрии, ядерно-активационного анализа, ионселективных электродов, а также другими способами. Эти и другие методы определения металлов описаны в работах [106—109].

Некоторые элементы, например кальций, определяют с помощью быстрой и удобной методики, которая основана на титрометрии и не требует специального оборудования. Элементы, мешающие определению, а также соединения, присутствующие в малых количествах, иногда удаляют соответствующей обработкой пробы. Такие методики описаны в работах [109, ПО].

Метод пламенно-эмиссионной фотометрии [107, 108] идеально подходит для анализа щелочных и щелочноземельных металлов. С помощью атомно-абсорбционной спектроскопии можно обнаруживать миллионные доли приблизительно 40 элементов в различных образцах [107]. Принципы этих методов обсуждаются в работах [107, 108]. Некоторые металлы анализируют точным и относительно удобным методом атомной абсорбции [106, 108]. Для этого метода требуется специальный спектрофотометр, на котором может работать лишь опытный персонал. Присутствие в образце нескольких элементов и соединений мешает атомно-абсорбционному анализу исследуемого элемента, но при правильной обработке образца влияние помех уменьшается или может быть совсем устранено.

Ядерно-активационный анализ [108] основан на облучении образца с целью получения одного или нескольких радиоактивных элементов. Радиоактивные образцы идентифицируют и измеряют их количество. Преимуществами этого вида элементного анализа являются высокая чувствительность и возможность определения многих элементов в одном небольшом образце. Для применения этого метода необходимы источник нейтронов с высокой энергией (ядерный реактор или ускоритель), сложное оборудование для обнаружения изотопов, соответствующий компьютер и опытный персонал. При наличии необходимого оборудования применение этого метода требует относительно меньших затрат времени и средств, чем другие, если одновременно определяют несколько элементов в одном образце. Это особенно важно в случае, когда количество анализируемого материала ограниченно.

Рентгеновская эмиссионная спектроскопия [108] является методом анализа, позволяющим количественно определять и идентифицировать некоторые элементы, присутствующие в биологическом материале в большом количестве, причем исследуемый материал при этом не разрушается. Рентгеновский микроанализ с применением электронно-лучевого зонда используют для определения количества и местоположения некоторых элементов in situ. Разрешение анализа позволяет применять его по отношению к отдельным бактериальным клеткам и спорам [112]. Этот метод также требует сложного оборудования и специальной подготовки персонала, поэтому он доступен обычно лишь научно-исследовательским лабораториям.

Описаны методы колориметрического и нефеломет-рического определения металлов и неорганических соединений, включая автоматизированный анализ [109]; они опубликованы также в материалах Управления США по защите окружающей среды [ПО].

Имеющиеся в продаже ион-селективные электроды также представляют собой очень удобное и недорогое средство определения многих элементов, правда, их применение ограничено несколькими типами образцов и элементов (разд. 16.2.2).

17.9. ЛИТЕРАТУРА

Фракционирование и радиоактивность

1. Kennell D. Methods Enzymol., 12А, 686—692 (1967).

2. Roberts R. В., Cowie D В., Bolton E. Т., Abelson P. H., Britten R. J. Biosynthesis in Escherichia coli. Carnegie Inst. Washington Publ., 607, 1955.

3. Sutherland I. W., Wilkinson I. F. In: J. R. Norris and Ribbons D. W. (ed.), Methods in microbiology, vol. 5B, p. 346—383, Academic Press, Inc., New York, 1971.

Углеводы

Общая литература

4. Colowick J., Kaplan N. (ed.), Methods Enzymol., 8, 1—759 (1966).

5. Herbert D., Phipps P. J., Strange R. E. In: R. Norris and D. W. Ribbons (ed.), Methods in microbiology, vol. 5B, p. 209— 344, Academic Press, Inc., New York, 1971.

6. Work E. In: J. R. Norris and D. W. Ribbons (ed.), Methods in microbiology, vol. 5A, p. 361—418, Academic Press, Inc., New York, 1971.

Специальная литература

7. Dische Z. J. Biol. Chem., 204, 983—997 (1953).

8. Dische Z. Methods Carbohydr. Chem., 1, 477—514 (1962).

9. Elson L. A., Morgan W. T Biochem. J., 27, 1824—1828 (1933).

10. Fox G E., Magrum E. Batch W. E., Wolfe R. S., Woese C. R. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 74, 4537 (1977).

11. Ghuysen I.-M., Tipper D. I, Strominger I. L. Methods Enzymol., 12A, 695—699 (1966).

12. Hadzija O. Anal. Biochem., 60, 512—517 (1974).

13. Osborn M. J. Proc. Natl. Acad

страница 65
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84

Скачать книгу "Методы общей бактериологии. Том 2" (4.15Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(11.12.2019)