именения этой процедуры для растворения или экстракции белков реактив А заменяют реактивом, содержащим 20 г NaC03 в 1 л воды. В остальном методика остается той же.

Сульфат аммония в концентрации свыше 0,15% мешает развитию окраски. Об этом следует помнить, применяя эту методику к белкам, очищенным путем фракционирования, основанного на их различной растворимости в растворах сульфата аммония. Определению могут мешать и многие другие соли, некоторые сахара, глицин, трис-буфер, некоторые хелатирующие агенты и соединения с сульфгидрильными группами, если они присутствуют в больших концентрациях (1—5 М).

Развитию окраски мешают также ароматические аминокислоты, дающие окрашенный продукт в реакции с фенольным реактивом, и глицин.

Модификация метода Лоури, делающая его пригодным для измерения белка в пробах, содержащих сахарозу или ЭДТА, а также в препаратах мембран и липо-протеинов, описана Марквеллом и др. [91]. Эта методика основана на применении детергента (додецилсульфа-та натрия, ДСН) в составе щелочного карбонатного реактива для увеличения солюбилизации липоидных веществ и на использовании повышенного количества тартрата меди для предотвращения помех за счет сахарозы и ЭДТА. Методика применима в нескольких случаях, в том числе при определении белков во фракциях из сахарозных градиентов.

17.6.6. Определение белка с помощью биуретовой реакции [68, 82]

Благодаря присутствию пептидных связей в щелочных растворах белка образуются окрашенные в синий цвет хелаты с ионами меди. Эта реакция гораздо менее чувствительна, чем метод Лоури, однако она занимает меньше времени и может протекать в присутствии солей аммония и других веществ, мешающих определению белка по методике Лоури. Кроме того, при таком анализе интенсивность окраски на единицу веса белка у различных белков варьирует меньше.

В описываемой ниже модификации биуретовой реакции [83] используется тартрат, образующий с медью комплексы, которые растворимы в NaOH. Белок вытесняет ион меди из комплекса, в результате чего изменяются цвет и интенсивность поглощения.

Реактивы

1,5 г сульфата двухвалентной меди (CuS04-5H20) и 6 г калий-натрийтартрата-4Н20 растворяют в 500 мл воды. Добавляют с перемешиванием 300 мл 10%-ного (вес/объем) NaOH. Объем смеси доводят до 1 л дистиллированной водой. При появлении в реактиве осадка красноватого или черного цвета его выбрасывают.

Методика

4 мл биуретового реактива, приготовленного, как описано выше, добавляют к нейтрализованной пробе (1 мл), содержащей 1—10 мг белка. Тщательно перемешивают и инкубируют при комнатной температуре 30 мин. Время и температура должны быть строго одинаковыми для всех проб, в том числе для стандартных и контрольных. Оптическую плотность измеряют при 500 нм. Контрольную пробу готовят, смешивая 1,0 мл воды или водного раствора, применявшегося для растворения белков, и 4,0 мл биуретового реактива. Стандартную кривую строят, используя любой хорошо растворимый белок, например кристаллический бычий сывороточный альбумин. Кривая имеет нелинейный характер из-за конкуренции между тартратом и белком за ионы меди.

Применение методики

Описанный Стикландом [102] модифицированный вариант этой методики применим для определения суммарного белка в бактериальных клетках. В этом случае в 1,0 н. NaOH растворяют клеточный белок, а затем CuS04, не добавляя тартрата. Нерастворимый клеточный материал и Си(ОН)2 удаляют центрифугированием, при этом окрашенный комплекс Си — белок остается в растворе.

17.6.7. Определение белка по реакции с кумаси синим

Белки могут связываться с некоторыми красителями, в результате чего происходит сдвиг полос поглощения последних. В описываемой ниже методике в качестве красителя используют кумаси яркий синий. Этот краситель существует в двух видах: его красная анионная форма переходит в синюю, когда краситель присоединяется к аминогруппам белков. Протекающие при этом реакции в большинстве случаев более чувствительны и менее подвержены вредному воздействию многих соединений, ограничивающих применение других способов определения белка [78]. Эксперимент с применением красителя занимает гораздо меньше времени, чем процедуры в описанных выше методиках. Чувствительность реакции с красителем сравнима с чувствительностью метода Лоури. Она меньше зависит от вида белка по сравнению с цветными реакциями в описанных выше методиках.

Реактив

100 мг кумаси яркого синего G250 растворяют в 50 мл 95%-ного этанола. Добавляют 100 мл 85%-ной (вес/объем) фосфорной кислоты. (Предостережение) Сильная кислота! Ее нельзя насасывать в пипетку ртом. Необходимо работать в защитных перчатках, очках и лабораторной одежде.) Объем доводят до 1 л дистиллированной водой.

Методика

К раствору, содержащему от 10 до 100 мкг белка в 0,1 мл, добавляют 5 мл красителя и тщательно перемешивают. Оптическую плотность при 595 нм измеряют не раньше чем через 2 мин и не позже чем через 1 ч. Для сравнения используют контрольную пробу, содержащую 0,1 мл буферного раствора и 5 мл красителя.

Содержание белка в пробе определяют по калибровочной кривой, отражающей зависимость между оптической плотностью стандартных растворов (содержащих от 5 до 100 мкг белка в 1 мл того же буфера, который использовался для растворения опытных проб) и концентрацией белка в каждом стандартном растворе (разд. 16.1.1).

Применение методики

Методика пригодна для определения многих растворимых белков. Детергенты мешают проявлению окраски, поэтому стеклянную посуду необходимо хорошо споласкивать водой. Линейность сохраняется лишь в интервале от 25 до 75 мкг белка в пробе. Другие недостатки этого метода описаны Пирсом и Султером [95].

Имеются описания микро- и других вариантов этой методики, отличающихся высокой воспроизводимостью и позволяющих обнаруживать 1,0 мкг белка [101].

17.6.8. Определение белка спектрофотометрическим методом

Максимум поглощения белков наблюдается при 280 нм; он обусловлен присутствием в белках ароматических аминокислот — тирозина и триптофана. Эти две аминокислоты входят в состав почти всех белков, и диапазон колебаний отношения их содержания к содержанию других аминокислот довольно узок. Определение белков в растворе по оптической плотности раствора в

УФ-области целесообразно, если раствор белка содержит не более 20% (по весу) других соединений, поглощающих УФ-свет, таких, как нуклеиновые кислоты или фенолы, и если он не мутный.

Поправку на поглощение нуклеиновых кислот в растворе, содержащем белок, можно сделать по методу Варбурга и Кристиана [105] или методу Калкара [87].

Оборудование

Спектрофотометр, позволяющий проводить измерения в УФ-области (разд. 16.1.1).

Кварцевые кюветы, пропускающие УФ-свет.

Методика

Оптическую плотность белков, растворенных в соответствующем буфере, измеряют при 280 и 260 нм. При каждой длине волны измерения проводят относительно контрольной пробы, содержащей буфер. Если отношение оптической плотности при 280 нм к оптической плотности при 260 нм не превышает 1,70, за исключением растворов, о которых известно, что они содержат чистый белок, то концентрацию белка определяют по приведенному ниже уравнению [87] или с помощью соответствующей таблицы [89]. Уравнение используется для того, чтобы учесть вклад, который вносит оптическая плотность нуклеиновых кислот в оптическую плотность раствора:

Концентрация белка (мг/мл) = 1,45 А280—0,74 А26о.

Применение методики

Если важно сохранить пробу малодоступного белка, эта методика незаменима. После измерения оптической плотности белок можно использовать в дальнейших исследованиях. Различные белки могут иметь разные коэффициенты экстинкции, поэтому если важна точность измерений, то стандартные растворы следует готовить из одного и того же белка.

17.6.9. Суммарный азот

Общее содержание азота в пробе определяют, суммируя результаты анализов для отдельных азотсодержащих компонентов (N02~, NO3-, NH4+ и органических соединений). Однако если исследователя интересует только суммарный азот, то проведение всех этих анализов, занимающее много времени, излишне. Чаще всего для определения суммарного азота применяют метод Кьель-даля, заключающийся в разложении органических азотсодержащих соединений с образованием NH^ и последующем анализе этого иона по одной из известных методик. Этот анализ включает определение ЫОз- и N02~, восстановленных до NH44- подогретой щелочью [68] или салициловой кислотой и цинком [65]. Другой способ, позволяющий использовать реактивы, приготовленные для анализа N02~, заключается в окислении NH4+ до нитрита и последующем анализе нитрита.

Способ расщепления органического вещества зависит от состояния пробы (твердого или жидкого). Поскольку методики расщепления по Кьельдалю разнообразны и сложны, а описания их приводятся в различных статьях, мы рекомендуем читателю обращаться к указанным ниже литературным источникам. Методы расщепления по Кьельдалю, разработанные для жидких проб, включают анализ морской [73] и озерной [64, 68] воды, а также сточных вод [64, 68]. Среди твердых проб могут быть образцы почвы [64—66, 71], осадочных пород [68], удобрений [70], веществ растительного [64, 70] и животного происхождения [70], а также микроорганизмов [68].

17.6.10. Молекулярный азот

Необходимость обнаружения молекулярного азота в биологической системе обычно ограничивается работами по азотфиксации, в которых азот (двухатомный азот) восстанавливается с помощью ферментной системы (называемой нитрогеназой) до аммиака, ассимилируемого клетками. Количественный анализ этой реакции основан на исчезновении азота, который раньше определяли с помощью атомной абсорбции, или на появлении аммония и его измерении по описанному выше методу (разд. 17.6.3). Однако азотфиксацию легче измерять по способности нитрогеназы восстанавливать ацетилен (С2Н2) ДО этилена (С2Н4). Ацетилен и этилен определяют с помощью газовой хроматографии. Восстановление ацетилена обычно определяют в системах, обладающих достаточно высокой нитрогеназной активностью. Это позволяет осуществлять кратковременное воздействие на ацетилен, что сводит к минимуму