Биологический каталог




Методы общей бактериологии. Том 2

Автор Ф.Герхардт

оду Несслера) NH4+ определяют в реакции со ртутью и иодидом калия в щелочном растворе, где он образует окрашенное соединение, которое анализируют с помощью спектрофотометра или колориметра [64, 68]. Основной недостаток этого способа — необходимость применения ртутных соединений. Оба метода описаны ниже.

Еще одна почти столь же простая методика позволяет использовать реактивы, приготовленные для определения N02~; она заключается в окислении NH4+ до N02~ [73] и последующем определении N02. Однако для окисления NH4, которое занимает 3,5 ч, необходимы дополнительные реактивы, поэтому мы рекомендуем применять индофеноловый метод или метод Несслера.

При необходимости очень специфического способа определения NH4+ наиболее удобным может быть пи-ридин-пиразоловый метод [73, 88]. См. также разд. 16.2.2.

Обработка проб

Пробы обрабатывают, как описано в разд. 17.6.1. При большом содержании мешающих определению веществ (табл. 17.1) иногда некоторые реактивы приходится перед проведением анализа перегонять [68].

Реактивы

Вода, не содержащая аммония. На каждый 1 л дистиллированной воды добавляют по 0,1 мл концентрированной H2SO4 (осторожно: H2SO4 — едкое соединение; нельзя насасывать ее в пипетку ртом и допускать ее разбрызгивания) и проводят перегонку. Для каждой серии проб готовят свежую воду, так как она быстро загрязняется парами NH4+ из окружающего воздуха. Можно также использовать ионообменную колонку. Выбирают ионообменную смолу, максимально связывающую NH4+ и другие мешающие определению органические вещества.

0,003 М MnS04: 50 мг MnS04-H20 растворяют в 100 мл дистиллированной воды, очищенной от NH4+.

Гипохлоритный реактив: смешивают 10 мл имеющейся в продаже хлорной извести (5%-ный раствор гипохлорита) и 40 мл дистиллированной воды, очищенной от ионов NH4+. рН доводят до 6,5—7. Каждую неделю готовят свежий раствор.

Феиолятный реактив: 2,5 г NaOH и 10 г фенола растворяют в 100 мл дистиллированной воды, очищенной от NH4+. Еженедельно готовят свежий раствор. (Осторожно! Фенол быстро проникает через кожу и вызывает сильные ожоги. Твердый фенол взвешивают в перчатках, фартуке и защитных очках. Работают в вытяжном шкафу, избегая вдыхания паров. Нельзя насасывать фенол в пипетку ртом.)

Стандартные растворы NH4+. Готовят основной раствор NH4+, растворяя 381,9 мг безводного NH4C1 (высушенного при 100°С) в воде, не содержащей NH4+, и доводят объем до 1 л. 1 мл такого раствора содержит 100 мкг азота и 122 мкг NH3. Стандарты получают разбавлением основного раствора до концентраций от 0,1 до 5 мкг аммонийного азота на 10 мл.

Методика

В небольшой химический стакан или колбу помещают 10 мл пробы и 0,05 мл (1 каплю) раствора MnSC>4. При постоянном перемешивании (для этого лучше всего пользоваться магнитной мешалкой) добавляют 0,5 мл гипохлоритного реактива. Затем сразу же добавляют по каплям 0,6 мл фенолятного реактива.

Реакция протекает 10 мин с образованием устойчивой в течение 24 ч окраски. Интенсивность окраски измеряют с помощью колориметра или спектрофотометра при 630 нм. Контрольную пробу и калибровочную кривую готовят ежедневно, так как при хранении реактивов интенсивность окраски может меняться.

17.6.4. Определение аммония методом Несслера

Пробы

Пробы обрабатывают, как описано в разд. 17.6.1. При большом содержании мешающих определению веществ (табл. 17.1) может потребоваться предварительная перегонка реактивов [68].

Реактивы

Вода, не содержащая аммония. Готовят, как описано в разд. 17.6.3.

Реактивы для удаления больших количеств мешающих определению катионов: 100 г ZnS04-7H20 растворяют в воде, не содержащей аммония, и доводят объем до 1 л. 6 н. NaOH готовят растворением 240 г NaOH в воде, не содержащей аммония и доводят объем до 1 л.

Реактив для удаления следовых количеств мешающих определению катионов. 50 г №2-ЭДТА растворяют в 60 мл воды, очищенной от аммония, но содержащей 10 г NaOH. (Для растворения реактивов может потребоваться нагревание.) Охлажденный раствор разбавляют до 100 мл водой, не содержащей аммония.

Реактив Несслера. 100 г Hgl2 и 70 г KI смешивают в минимальном количестве воды (100—200 мл). Эту смесь медленно с перемешиванием добавляют к 500 мл 8 н. NaOH (20—25 °С). Доводят объем до 1 л и хранят в стеклянной посуде с резиновой пробкой в темном месте. Реактив устойчив в течение года. (Осторожно! Реактив Несслера токсичен. Нельзя насасывать его в пипетку ртом или допускать его разбрызгивание. Остатки необходимо ликвидировать с соблюдением соответствующих для ртутных препаратов предосторожностей.) Реактив проверяют ежемесячно, сравнивая стандартную кривую для аммонийного азота со стандартной кривой, полученной со свежим реактивом. При появлении значительных отклонений в калибровочной кривой старый реактив ликвидируют.

Стандартные растворы NH4+. Готовят основной раствор NH4+, как описано в разд. 17.6.3, и разбавляют его для получения растворов с концентрациями от 20 до 500 мкг/50 мл.

Методика

Мешающие определению NH4+ ионы Са, Mg, S и Fe удаляют двумя способами. При высоком содержании этих ионов к 100 мл пробы добавляют 1 мл раствора ZnS04. Измеряют на рН-метре рН и доводят его до 10,5, добавляя 0,4—0,5 мл 6 н. NaOH. Мешающие определению ионы осаждаются в течение 15 мин. Осадок обычно содержит и другие суспендированные вещества. Его удаляют фильтрованием через бумагу, не содержащую NH4+, или центрифугированием. Если показано, что в пробе содержатся лишь следовые количества мешающих определению NH4+ ионов, к 50 мл пробы добавляют 0,05 мл (1 каплю) раствора ЭДТА, тщательно перемешивая. Пробы, предварительно обработанные ZnS04 и щелочью, часто обрабатывают также ЭДТА. Образцы, не содержащие мешающих определению NH4+ катионов, можно анализировать с помощью реактива Несслера без предварительной обработки.

Для осуществления реакции к 50 мл пробы добавляют 1 мл реактива Несслера. Для пробы, обработанной ЭДТА, берут 2 мл реактива Несслера. Смесь хорошо перемешивают и оставляют при комнатной температуре, по крайней мере на 10 мин. (При низком содержании NH4+ лучше оставить на 30 мин.) Все пробы обрабатывают в строго одинаковых условиях, в том числе стандартные и контрольные. Оптическую плотность образовавшегося окрашенного соединения измеряют при длине волны между 400 и 425 нм для проб и стандартов с низким содержанием NH4+ (20—250 мкг/50 мл) и между 450 и 500 нм при высокой концентрации NH4+ (250— 500 мкг/50 мл). При необходимости реакцию можно проводить с пропорционально меньшими количествами пробы, стандартных растворов и реактивов. Чувствительность определения NH4+ можно повысить до 5 мкг/50 мл, если использовать кювету толщиной 5 см. Количество аммиака в каждой пробе определяют по калибровочной кривой, отражающей зависимость между оптической плотностью каждого стандарта и концентрацией аммиака в стандартном растворе (разд. 16.1.1).

17.6.5. Определение белка с помощью реактива Фолина

Наиболее распространенным колориметрическим способом определения белков является метод Лоури и др. [90] с использованием реактива Фолина. В реакции с этим реактивом получают синее окрашивание в результате взаимодействия белка с ионом меди в щелочном растворе (биуретовая реакция) и восстановления фосфомолибдат-фосфовольфрамовой кислоты в составе реактива Фолина ароматическими аминокислотами анализируемого белка.

Описываемая ниже методика применима как к белкам, уже находящимся в растворе, так и к белкам, растворимым в разбавленных щелочах.

Реактивы

Реактив А: 20 г Na2C03 растворяют в 1 л 0,1 н. NaOH.

Реактив Б: 0,5 г CuS04-5H20 растворяют в 100 мл 1%-ного (вес/объем) водного раствора тартрата натрия.

Реактив В: непосредственно перед использованием смешивают 50 мл реактива А и 1 мл реактива Б, раствор хранят не более одного дня, затем готовят новый.

Реактив Г: разбавленный реактив Фолина. Концентрированный реактив Фолина — Чиокальто, поставляемый несколькими фирмами (например, Fisher Scientific Co., Pittsburg, Pa.), разбавляют согласно приложенной инструкции. (Предостережение! Этот реактив содержит сильную летучую кислоту, его нельзя насасывать в пипетку ртом. При работе необходимо надевать защитные перчатки, одежду и очки, особенно при использовании встряхивателя Vortex.)

Стандартный раствор белка. Пригодны любые имеющиеся в продаже препараты белков или стандартные растворы. Кристаллический бычий сывороточный альбумин или растворы бычьего сывороточного альбумина, приобретенные у фирм, дают вполне приемлемые калибровочные кривые. Основной стандартный раствор должен содержать 0,5 мг белка на 1 мл дистиллированной воды. С различными белками получают различные калибровочные кривые. При опубликовании результатов следует указывать, какой стандарт белка использовался в работе.

Методика

Пробы, содержащие 50—250 мкг белка (в объеме до 1 мл) вносят в пробирки. Объем каждой пробы доводят до 1,0 мл дистиллированной водой. Добавляют по 5,0 мл реактива В и хорошо перемешивают. Смесь оставляют, по крайней мере, на 10 мин, при комнатной температуре. Добавляют 0,5 мл реактива Г и сразу же перемешивают. Реактивность этого реагента к добавленному белку сохраняется всего несколько секунд после разбавления. Пробы оставляют при комнатной температуре в течение 30 мин или более и измеряют оптическую плотность при 500 нм с помощью спектрофотометра или колориметра. Метод обладает большей чувствительностью, если измерять оптическую плотность при 750 нм в соответствующем спектрофотометре.

Если есть кювета на 1 мл и соответствующий прибор, все объемы можно уменьшить в 5 раз, сохранив тем самым часть реактивов и пробы. Объем проб и стандартных растворов может быть 0,2 мл, а реактивов В и Г, добавляемых через указанные промежутки времени,— 1,0 и 0,1 мл соответственно.

Когда определяют белок в клетках бактерий или анализируют белки, не растворимые в разбавленной щелочи, необходимо нагревать суспензию при 90°С в 1 н. NaOH в течение 10 мин для полной солюбилизации. Стандартный раствор обрабатывают подобным образом, так как в результате такой обработки снижается интенсивность окраски. В случае пр

страница 63
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84

Скачать книгу "Методы общей бактериологии. Том 2" (4.15Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(10.12.2019)