и будет значительно больше для частичных ревертантов и супрессированных штаммов, чем для полных ревертантов. Можно также нанести клетки разных штаммов с обратными мутациями прямо в чашки на минимальный агар, содержащий 5-метилтриптофан (0,01 мкг/мл), и сравнить скорости их роста с наблюдаемыми на минимальном агаре без аналога.

Более трудоемкий и требующий больших затрат времени метод различения полных и частичных ревертантов и супрессированных штаммов включает изучение активностей ферментов в рамках тех биохимических функций, которые затрагиваются соответствующей мутацией. Если такую функцию нетрудно проверить, можно сравнить количество и стабильность фермента у различных ревертантов и бактерий дикого типа. Подобного рода анализ, однако, может привести к неправильным выводам из-за существования регуляторных воздействий мутаций в структурных генах на количественный уровень синтезируемых в клетке ферментов. Например, в случае трип-тофановой или других репрессируемых ферментных систем дерепрессия в отношении деятельности ферментов системы более выражена у частичных ревертантов и супрессированных штаммов, чем у клеток дикого типа, так как конечный продукт у первых синтезируется в ограниченных количествах, что приводит к своего рода голоданию клетки. Тот или иной фермент в клетках с частично обращенной мутацией может иметь очень низкую удельную активность, но его фактическое количество (по отношению к общему белку клетки) может в результате дерепрессии стать в неколько раз больше, чем у дикого типа (см., например, работы [6, 9]).

13.6. НЕПРЯМОЕ ВЫЯВЛЕНИЕ МУТАЦИИ

Большинство мутантных типов нельзя выявить методами прямого отбора, описанными в предыдущем разделе. Для любой мутации, связанной с потерей генетической функции, требуются такие методы выявления, которые позволили бы идентифицировать очень редко возникающий тип мутанта на большом фоне немутант-ных клеток. В эту группу входят ауксотрофные мутанты, мутанты с изменениями в системе сбраживания углеводов, морфологические варианты различных типов и другие условно летальные мутанты.

Самыми распространенными методами непрямого выявления таких мутантов являются случайный поиск соответствующих колоний и метод перепечатывания колоний с одной чашки на другую (метод отпечатков). Оба метода требуют проверки большого числа бактериальных колоний. По существу, эти методы отличаются только способом осуществления этой проверки. В методе случайного поиска одномоментно со среды на среду переносится одна колония — пока не обнаружится вызванное мутацией нарушение. Это утомительная и требующая больших затрат времени процедура. Поэтому иногда такой метод называют подходом «в лоб». Один из способов повышения вероятности выявления нужного мутанта «в лоб» этим методом — использование в качестве компонента среды, на которую делают посев, подходящего меняющего цвет субстрата. В одном из примеров такого подхода, который приводится ниже, мутанты, не способные сбраживать лактозу, выявляют благодаря включению в среду красителя тетразолия [15].

13.6.1. Мутанты по системе брожения

1. Выращивают посевной материал соответствующей сбраживающей лактозу бактерии в L-бульоне (разд. 13.9.1) или питательном бульоне (разд. 13.9.11).

2. Подвергают культуру действию мутагена и затем дополнительно выращивают ее, как описано в разд. 13.3.

3. Определяют плотность клеток в культуре с помощью колориметра Клетта — Саммерсона или какого-нибудь другого прибора для измерения мутности. Делают посев соответствующих разведений в чашки с лакто-зо-тетразолиевым агаром (разд. 13.9.3) с таким расчетом, чтобы получить 50—100 колоний на чашку.

4. Инкубируют до тех пор, пока колонии не достигают в диаметре 2—3 мм. Колонии родительского положительного по сбраживанию лактозы штамма имеют белый цвет, тогда как колонии отрицательные по сбраживанию лактозы ярко-красные. В основе этого различия в окраске лежит выделение кислоты бактериями, сбраживающими лактозу. В слабо забуференной среде выделяющаяся при брожении кислота снижает значение рН и предотвращает восстановление красителя. В то же время колонии клеток, не сбраживающих лактозу, сохраняют присущую им способность восстанавливать тетра-золий до его окрашенной в красный цвет формы.

Возможные трудности

Важно, чтобы колонии на чашках не были посеяны слишком часто, так как выделение кислоты бактериями в колониях дикого типа может препятствовать восстановлению тетразолия и отрицательными по сбраживанию лактозы колониями. Разведения должны быть подобраны с таким расчетом, чтобы на чашку приходилось не более 100 колоний. Важно также, чтобы лактоза была высококачественная, без примеси глюкозы; иначе результаты могут быть искажены слабым сбраживанием глюкозы, что часто случается при использовании лактозы, содержащей примесь глюкозы (см. список реактивов в разд. 13.10.2).

Эта общая тактика поиска применима для любого мутанта, для которого удается найти подходящий субстрат, позволяющий благодаря изменению окраски различать колонии мутантов. В качестве примеров можно указать на применение п-нитрофенилфосфата для выявления фосфатазных мутантов, красителя Гимзы или метилового зеленого для выявления мутантов по нуклеа-зам и диазотированных производных казеина, коллагена или альбумина для выявления мутантов по протеолити-ческим ферментам. Солюбилизация желатины (которая сама по себе не является цветовым индикатором), сопровождающаяся переходом из опалесцирующей формы в прозрачную, уже давно используется для измерения протеолитической активности. Подобным образом нук-леазную активность можно выявлять по солюбилизации РНК и ДНК, включенных в агар в виде кислотонерас-творимых компонентов.

13.6.2. Выявление ауксотрофов

(метод отпечатков)

В 1952 г. Ледерберг и Ледерберг [17] разработали для непрямого отбора бактериальных мутантов метод отпечатков с чашки на чашку.

Этот метод, схема которого изображена на рис. 13.2, позволяет с помощью кусочка бархата (разд. 13.9.16) в один прием переносить большое число колоний с одной твердой среды на другую. Более того, при этом во второй чашке колонии располагаются точно так же, как в первой. Это позволяет быстро проверять большое число индивидуальных колоний на наличие мутантных признаков. Сначала на неселективную полную среду высевают нужное разведение той культуры, которую подвергли действию мутагена. Затем выросшие колонии «перепечатывают» на селективную или минимальную среду. Колонии, которые растут на среде с соответствующей добавкой и не растут на минимальной среде, отбирают и проверяют на наличие мутаций. Пользуясь этим мето

дом, за короткое время можно проверить несколько тысяч колоний, при этом не нужно отбирать и перевивать каждую колонию по отдельности. Метод отпечатков особенно полезен для выделения ауксотрофов, которые растут на полной среде, но не растут на минимальной. Добавляя к минимальной среде, на которую переносят колонии, определенные вещества, можно выявить ауксотрофы определенного типа (например, по одной аминокислоте, витамину, предшественнику нуклеиновой кислоты). Если применять высокоэффективный мутаген, такой, как НТГ, этим методом можно получить до 20% ауксотрофов от общего числа клеток или 1—2% мутантов определенного типа. Данный подход иллюстрирует приведенный ниже пример выделения ауксотрофных мутантов различных типов. См. также разд. 20.2.5.

Методика

1. Исследуемую бактерию подвергают действию мутагенного фактора, желательно широкого спектра действия (например, ультрафиолета).

2. Выращивают обработанные клетки в питательном бульоне (разд. 13.9.11), чтобы выявить возникшие мутации. Если нужно получить ряд независимых мутаций, следует перед выращиванием поделить культуру на несколько порций.

3. Высевают необходимые разведения в чашки с питательным агаром (разд. 13.9.12) и инкубируют чашки вверх дном при 37 °С.

4. По достижении колониями размера около 3 мм в диаметре «перепечатывают» их в чашки с минимальным агаром (разд. 13.9.10 или 13.9.15) и питательным агаром (разд. 13.9.12). Когда колонии вырастают, выявляют те из них, которые есть на питательном агаре, но отсутствуют на минимальном агаре.

На этой стадии (последней из отраженных схемой на рис. 13.2) методика позволяет выявить лишь всю совокупность ауксотрофов; пока нельзя ответить на вопрос, какие именно изменения произошли в тех или иных конкретных звеньях обмена веществ ауксотрофов. Чтобы идентифицировать различные типы ауксотрофов, выполняют следующие дополнительные этапы.

5. Отбирают выявленные колонии ауксотрофов с помощью стерильных зубочисток, размазывают массу клеток пятнами размером 0,6 см в диаметре каждое в чашках с питательным агаром (разд. 13.9.12) и инкубируют

при 37 °С. В каждой чашке должно находиться по 40—

50 пятен.

6. «Перепечатывают» клоны, выросшие из пятен, на минимальный агар (разд. 13.9.10 или 13.9.15) с добавками метаболитов в девяти различных комбинациях (табл. 13.3) и без добавок.

7. Определяют, при наличии каких наборов метаболитов растет обнаруженный мутант. Эти данные дают возможность сделать вывод о природе нарушения, вызванного мутацией. Например, мутант, который растет при добавлении 3-го и 6-го наборов, относится, по всей вероятности, к цистеинзависимым мутантам, а 5-го и 9-го наборов — к аргининовым ауксотрофам. Затем, чтобы убедиться в правильности предварительных выводов, проверяют рост каждого клона на минимальном агаре с той добавкой, от которой, как предполагают, зависит данный ауксотроф.

Возможные трудности

Некоторые ауксотрофы отвечают только на одну комбинацию добавок или вообще не отвечают ни на одну из них. Первый случай может быть обусловлен следующими факторами: 1) двумя независимыми мутациями, приводящими к потребностям в разных питательных веществах, которые могут находиться в одном наборе метаболитов; 2) мутацией, затрагивающей один из первых этапов разветвляющегося метаболического пути (например, штамм с дефектом синтеза полиароматических кислот растет только на среде с добавлением 8-го набора); 3) эффектами ингибирования другими метаболитами набора. Мутанты