ипящей бане в течение 2 мин. Раствор охлаждают и центрифугируют 15 мин при 10 000 g при комнатной температуре. Надосадочную фракцию переливают в 10-мл мерную колбу, а осадок дважды экстрагируют 3 мл хлороформа в течение 2 мин при 100°С. Если раствор непрозрачный, его фильтруют горячим через фильтровальную бумагу Whatman № 1 (предварительно промытую горячим хлороформом). Хлороформные экстракты объединяют и доводят хлороформом до 10 мл. Все операции с хлороформом выполняют в вытяжном шкафу. (Предостережение! См. разд. 17.3.1.)

Пробы хлороформного экстракта, содержащие от 5 до 50 мкг полимера и 5—10 стандартных растворов, в состав которых входит от 5 до 50 мкг р-гидроксимасля-ной кислоты в этаноле, вносят в стеклянные термостойкие пробирки. Пробирки погружают в кипящую водяную баню до выпаривания растворителей. Добавляют по 10 мл серной кислоты, закрывают пробирки стеклянными шариками и нагревают в кипящей водяной бане 10 мин. Растворы охлаждают и тщательно перемешивают.

Измеряют оптическую плотность растворов при 235 нм, используя в качестве контроля серную кислоту (разд. 16.1.1). Количество р-гидроксибутирата определяют по калибровочной кривой. Количество поли-р-гид-роксибутирата на 1 г сухого веса биомассы бактерий рассчитывают исходя из сухого веса клеток в культуре.

Применение методики

Описанная выше методика подходит для определения количества поли-р-гидроксибутирата в лиофилизо-ванных клетках или в биомассе, полученной при центрифугировании. Определению мешают другие р-гидрокси-кислоты и некоторые сахара, так как они превращаются в вещества, поглощающие УФ-свет при 235 нм. Сахара удаляют обработкой гипохлоритом с последующей экстракцией поли-р-гидроксибутирата хлороформом. Другие клеточные вещества также иногда образуют продукты, поглощающие УФ-свет. Рекомендуется сравнивать спектр поглощения вещества, образуемого бактериальными клетками, со спектром поглощения стандарта для того, чтобы убедиться, что поглощение обусловлено кро-тоновой кислотой (разд. 16.1.1).

17.4. ПОЛИМЕРЫ КЛЕТОЧНОЙ СТЕНКИ

Химические и структурные различия клеточных стенок грамположительных и грамотрицательных бактерий весьма значительны. У грамположительных бактерий пептидогликаны могут составлять 40—90% веса выделенных клеточных стенок (15—20% веса сухих клеток), у грамотрицательных — менее 10%, а у некоторых псевдомонад—всего 1,2% [35—38, 44, 45, 58]. Этот полимер контролирует форму прокариот, за исключением мико-плазм, галобактерий, метанобразующих бактерий и других видов, относящихся к архебактериям [49]. Пепти-догликан большинства бактерий имеет основную цепь, состоящую из чередующихся остатков N-ацетилглюкоза-амина и N-ацетилмурамовой кислоты, связанных р (1—И:)-гликозидными связями. Небольшие отклонения от этой структуры наблюдаются у некоторых видов Streptomyces [38], у которых имеется N-гликоилмурамо-вая кислота. В кортексе эндоспор бактерий найден модифицированный пептидогликан, содержащий мурами-ловый лактам {55].

Тетрапептид присоединяется к карбоксильной группе З-О-О-молочной кислоты, связанной с остатками N-ацетилмурамовой кислоты. Порядок расположения аминокислот в тетрапептиде чаще всего следующий: L-ала-нин, D-глутаминовая кислота, диаминовая кислота и концевой D-аланин. К диаминовым кислотам в составе тет-рапептида относятся мезо- и LL-диаминопимелиновая кислота, L-лизин, L-орнитин и L-диаминомасляная кислота. Эти и некоторые другие отклонения в структуре тетрапептида рассматриваются в работах Гуйзена [40], Роджерса и др. {45] и Камминса [38].

Тетрапептидные цепи поперечно связаны друг с другом. Количество и природа поперечных связей у различных организмов различны. Это может быть прямая пептидная связь между двухосновной аминокислотой в одном тетрапептиде и D-аланином другого тетрапептида или соединение двух тетрапептидов посредством одной или нескольких аминокислот [36, 38, 45, 48].

Наличие N-ацетилмурамовой кислоты только в пеп-тидогликане позволяет определять присутствие этого полимера в бактериальных клетках, а также проводить количественный анализ микробной биомассы в пробах почвы и воды. Диаминопимелиновая кислота обнаружена в макромолекулах только как компонент пептидогли-кана, поэтому положительные пробы на это соединение означают присутствие пептидогликана. Однако не все пептидогликаны содержат эту диаминокислоту {38].

Клеточные стенки грамположительных бактерий часто содержат также тейхоевые и тейхуроновые кислоты, белки и липотейхоевые кислоты. Тейхоевые кислоты — это сложные полимеры полиолов (рибита и глицерина), связанные в основной цепи фосфодиэфирными связями. Описаны некоторые отклонения в структуре основной цепи этих полимеров [38, 47]. Тейхоевые кислоты составляют 50% клеточной стенки некоторых грамположительных бактерий. Они являются хорошими антигенами, их серологическая реактивность используется для определения антигенных групп некоторых родов бактерий [47]. Тейхоевые кислоты клеточных стенок ковалентно связаны с пептидогликаном. Тейхоевые кислоты типа полимерных глицерофосфатов, называемые липотейхоевыми кислотами, ковалентно связаны с гликолипидами. Они обнаружены в плазматической мембране после разрушения клеток. Наиболее распространенные антигенные детерминанты — это сахара или аминосахара, присоединенные через гидроксильные группы к полиолам основной цепи. Часто бывает связан с полиолами аланин.

Тейхуроновые кислоты представляют собой кислые полисахариды, которые содержат уроновые кислоты, но не содержат фосфаты. Полимеры глюкуроновой кислоты с N-ацетилглюкозамином и полимеры аминоманнуроно-вой кислоты с глюкозой встречаются у Bacillus licheni-formis и Micrococcus lysodeikticus соответственно. Другие полимеры уроновой кислоты были обнаружены в качестве компонентов клеточной стенки у ряда грамположительных бактерий [38].

Полисахариды клеточной стенки и липотейхоевые кислоты грамположительных бактерий, в частности

Стрептококков, определяют антигенные различия, позволяющие разделять эти бактерии на серологические группы [38]. Полисахариды клеточных стенок других грамположительных бактерий образуют неоднородную группу макромолекул, состоящую обычно из нейтральных Сахаров и иногда аминосахаров. Эти полисахариды имеют значение при дифференциации штаммов и видов, особенно в случае присутствия необычных или редко встречающихся Сахаров.

Белки широко распространены как компоненты клеточной стенки грамположительных бактерий. Поверхностные антигены стрептококков содержат различные кис-лоторастворимые белки [38].

Клеточные стенки у грамотрицательных бактерий намного сложнее, чем у грамположительных. Содержание пептидогликана в них значительно ниже, а у энте-робактерий пептидогликан ковалентно связан с липо-протеинами, которые, вероятно, образуют связь между пептидогликаном и наружной мембраной клеточной стенки. Наружный мембранный слой богат липополиса-харидами.

Липополисахариды — это чрезвычайно сложные молекулы с мол. массой выше 10 000 [35, 36, 39, 41, 44, 54, 57]. Липополисахариды Salmonella spp. состоят из трех частей: липидной, полисахаридного остова и О-полиса-харида. Липидная часть, которую называют липидом А, содержит фосфорилированный дисахарид глюкозамин, сильно этерифицированный по гидроксильным и аминогруппам жирными кислотами с 10—22 углеродными атомами в цепи. Основной жирнокислотный компонент фракции липида А—р-гидроксимиристиновая кислота, присущая только липидной части молекулы липополиса-харида.

Полисахаридный остов связывает липид А и О-поли-сахарид. Он состоит из четырех основных Сахаров, 2-ке-то-3-дезоксиоктановой кислоты, фосфата и этанолами-на. 2-Кето-З-дезоксиоктановая кислота присутствует только в этой части молекулы липополисахарида.

Полисахаридный остов Salmonella typhimurium содержит следующие сахара: глюкозу, галактозу, гептозу и глюкозамин ,[35, 57]. Он ковалентно связан вторым углеродным атомом 2-кето-З-дезоксиоктановой кислоты со вторым углеродным атомом глюкозаминового остатка липида А. Полисахаридный остов ковалентно связан также с вариабельными О-полисахаридными цепями. Несколько полисахаридных субъединиц могут быть связаны друг с другом пирофосфатными связями в липид-ьой части молекулы. Липид А встроен в наружную мембрану таким образом, что О-полисахариды выступают наружу [[35, 36]. О-Полисахариды являются главными антигенными детерминантами (О-антигеном) поверхности грамотрицательных бактерий. Они часто служат рецепторами для бактериофагов.

Тонкая структура и состав наружной мембраны грамотрицательных бактерий позволяют предполагать, что она представляет собой двойной слой, содержащий фосфолипиды и белки с различными количествами липо-полисахарида. Наружная мембрана ограничивает пери-плазматическое пространство — содержащий ферменты компартмент, связанный плазматической мембраной с внутренней частью клетки [35, 36],

Некоторые грамотрицательные клетки имеют наружную белковую или толстую полисахаридную оболочку, которая расположена снаружи от липополисахаридной зоны, выступающей из наружной мембраны [35, 36].

Было бы нецелесообразно описывать здесь все методы выделения и определения характеристик структурных компонентов клеточных стенок. Выбор метода зависит от исследуемого организма, имеющихся возможностей и целей исследования. Для одних исследований не требуются интактные высокоочищенные полимеры, для других, наоборот, необходимы и нативные, и чистые макромолекулярные вещества. Тот, кто хочет всесторонне охарактеризовать один из рассмотренных здесь полимеров бактерий, прежде всего должен ознакомиться с литературой, в которой описаны различные методы выделения, а также преимущества и ограничения каждого из них [35, 36, 57, 58]. Здесь даны самые простые методы выделения и получения предварительных характеристик пептидогликанов и липополисахаридов из наиболее распространенных в лабораторных исследованиях бактерий.

17.4.1. Пептидогликаны

Реактивы и оборудование

Физиологический раствор: 0,9%-иый (вес/объем) раствор NaCl

в дистиллированной воде

Ферментный препарат: кристаллический трипсин

Трис-буфер: 1,21 г триса