Биологический каталог




Методы общей бактериологии. Том 2

Автор Ф.Герхардт

в вытяжном шкафу и нагревают при П0°С -30 мин, охлаждают в эксикаторе и используют в день приготовления.

Стеклянные камеры, или сэндвич-камеры, для тонкослойной хроматографии можно приобрести у различных фирм. В камеры, предназначенные для большого числа пластинок за 2 ч до фракционирования наливают свежеприготовленный растворитель. Камеры выстилают фильтровальной бумагой, пропитанной растворителем, и герметично закрывают для создания равновесия.

Растворители. {Предостережение! См. разд. 17.3.1.)

Растворитель I: смесь хлороформа, метанола и воды (65:25: 4; по объему), приготовленная из перегнанных растворителей.

Растворитель II: смесь хлороформа, метанола и 7 и, гидроксида аммония (60 : 35 : 5; по объему).

Азот: жидкий в сосуде Дюара.

Мнкропнпетки: на 50 мкл, градуированные с интервалом 5— 10 мкл.

Методика

Высушенную фосфолипидную фракцию, полученную после разделения на колонке с флорисилом, растворяют в смеси хлороформа и метанола (1:1, по объему) до концентрации приблизительно 100 мг/мл). Объем раствора регистрируют. Измеренное количество каждого раствора наносят на хроматографическую пластинку в виде пятна диаметром 10 мм на расстоянии 2,5 см от нижнего и столько же от правого края. Пробу наносят с помощью градуированной пипетки на 50 мкл разового пользования. После каждого нанесения пятно сушат в токе азота. На одну пластинку наносят до 0,1 мл раствора. После высушивания в токе азота пластинку помещают в камеру с растворителем I. Камеру герметично закрывают и пропускают растворитель до тех пор, пока его фронт не достигнет верхнего края пластинки (обычно 1—2 ч). Пластинку вынимают и высушивают на воздухе, поворачивают на 90° по часовой стрелке по отношению к направлению первого растворителя и переносят в другую камеру с растворителем II. Этот растворитель пропускают во втором направлении и затем высушивают пластинку на воздухе.

Хроматограмму окрашивают парами йода, как описано ниже, для обнаружения пятен фосфолипидов. Ее слегка увлажняют над водяным паром и снимают сили-кагель в каждом пятне лезвием бритвы. Снятый сили-кагель переносят в отдельную пастеровскую пипетку с тампоном из стекловолокна в суженном ее конце. По пипетке слегка постукивают до тех пор, пока силика-гель не осядет в виде слоя на тампоне из стекловаты. Такую колонку из силикагеля промывают 2 мл смеси хлороформ — метанол (1:1, по объему), а затем 2 мл метанола для элюирования фосфолипидов. Элюаты собирают в пробирки со стеклянными пробками. Каждый фосфолипид разливают поровну в две 15-мл пробирки со стеклянными пробками и в ампулу для лиофилиза-ции и в дальнейшем анализируют. Растворители выпаривают при 37 °С в токе азота. Одна пробирка предназначена для анализа на суммарный органический фосфор с целью определения количества каждого присутствующего фосфолипида. Две другие пробы можно подвергнуть кислотному или щелочному гидролизу с последующей идентификацией веществ для установления их возможной структуры.

Окраска иодом для обнаружения липидов на хроматограммах [19, 20]

В хроматографическую камеру помещают кристаллы иода, закрывают ее и нагревают на водяной бане при 60 °С для выпаривания иода. (Предостережение/ Пары иода раздражают кожу. Они очень ядовиты и могут вызывать ожоги. Необходимо избегать попадания кристаллов иода на кожу и вдыхания паров. Все операции должны проводиться под тягой.) Хроматограммы помещают в камеру со стеклянными подставками, удерживающими их на расстоянии 2,5 см от дна камеры. Камеру закрывают на 1 мин, затем вынимают хроматограммы и рассматривают при дневном свете и под ультрафиолетовой лампой (365 нм). (Предостережние! УФ-свет может вызывать сильные ожоги глаз. При работе с ним следует надевать защитные очки.) Липиды видны в виде коричневых пятен при дневном свете и очень темных пятен — под УФ-лампой. Пятна обводят карандашом, до того как окраска начнет исчезать.

17.3.5. Определение фосфата в фосфолипидах

Количество фосфата в каждой фосфолипидной фракции, полученной с помощью тонкослойной хроматографии, можно определить по методике Бартлета, описанной Кейтсом [20].

Реактивы и материалы

Прозрачные пирекоовые пробирки размером 13X100 мм промывают в горячей 1 н. азотной кислоте в течение 1 ч и прополаскивают дистиллированной водой. Вся стеклянная посуда должна быть тщательно очищена от следов моющих средств и других источников загрязнения фосфором. (Предостережение! При работе с горячей азотной кислотой необходимо надевать резиновые перчатки, защитную одежду и очки. Все операции следует выполнять под тягой.)

Промытые кислотой стеклянные шарики обрабатывают вместе с пробирками, как описано выше.

Хлорная кислота- 72%-ный (объем/объем) раствор в дистиллированной воде. (Предостережение! Хлорная кислота и ее пары вызывают ожоги. При работе с ней необходимо надевать защитную одежду, перчатки и очки. Если в присутствии хлорной кислоты и окисляющих веществ нагревать раствор до 150 °С, может произойти пожар или взрыв)

Молибдат аммония: 5%-ный раствор (вес/объем) в дистиллированной воде.

Амидол: 0,5 г 2,4-диамннофенолдитидрохлорида добавляют к 50 мл 20%-ного (вес/объем) бисульфита натрия и раствор фильтруют.

Фосфорный стандарт (10 мкг фосфора/мл): растворяют 1,097 г КН2РО3 в 250 мл дистиллированной воды. Полученный раствор разбавляют 1 : 10 дистиллированной водой до концентрации фосфора 10 мкг/мл.

Методика

Известное количество липидов вносят в пробирку и выпаривают растворитель в токе профильтрованного воздуха или азота при 40 °С. Фосфорные стандарты, содержащие 1 —10 мкг фосфора в 1 мл (0,1—1,0 мл стандартного раствора), высушивают таким же образом. Добавляют 0,4 мл 72%-ной хлорной кислоты и закрывают пробирки промытыми кислотой стеклянными шариками. Нагревают при 100 °С до тех пор, пока раствор не станет прозрачным и бесцветным. Работают в вытяжном шкафу, приспособленном для процедур с хлорной кислотой. Добавляют 4,2 мл дистиллированной воды, 0,2 мл раствора молибдата аммония и 0,2 мл амидола. Перемешивают и закрывают каждую пробирку стеклянным шариком. Пробирки нагревают 7 мин в кипящей водяной бане. Быстро охлаждают их и через 15 мин измеряют оптическую плотность при 830 нм (разд. 16.1.1). Для настройки спектрофотометра на нуль используют контрольную пробу без фосфата. Концентрацию фосфата в каждой пробе определяют по стандартной калибровочной кривой, отражающей зависимость между концентрацией фосфата в стандартных пробах и оптической плотностью в них. Эта зависимость имеет линейный характер до концентрации фосфата 10 мкг/мл. Суммарное содержание фосфата в фосфолипидах можно выразить в микромолях каждого фосфолипида, допустив, что все они содержат по одной фосфатной группе.

17.3.6. Идентификация фосфолипидов [19, 20, 31]

Фосфолипиды можно деацилировать путем слабого щелочного гидролиза, приводящего к образованию водорастворимых глицерофосфатов и жирных кислот, растворимых в органических растворителях. Глицерофосфаты идентифицируют в специальных реакциях с образованием окрашенных продуктов по значениям R?t определенным с помощью хроматографии на бумаге [21]. Жирные кислоты лучше всего идентифицировать с помощью газожидкостной хроматографии метиловых эфи-ров (разд. 16.3.4).

Дополнительное подтверждение результатов идентификации фосфолипидов можно получить, анализируя свободные основания, образующиеся при кислотном гидролизе. Их определяют по значениям Rf и результатам окрашивания после разделения на бумажных хромато-граммах [19, 31].

Реактивы и материалы

Раствор гидроксида натрия в метаноле (0,2 н.): 0,4 г NaOH растворяют в 50 мл метанола. Используют свежеприготовленный раствор. (Предостережение! См. разд. 17.3.1.)

Раствор гидроксида аммония в метаноле (1,5 н.): 10 мл концентрированного гидроксида аммония разбавляют метанолом до 100 мл. (Предостережение! Гндроксид аммония (пары и жидкость) — едкая> щелочь. Все операции при работе с ним необходимо выполнять в вытяжном шкафу, надевая защитные перчатки, одежду и очки.)

Гидрокснд натрня (1,25 н.).

Хлороформ. (Предостережение! См. разд. 17.3.1.)

Метанол. (Предостережение! См. разд. 17.3.1.)

Катионообменная смола: Bio-Rad AG 50WX8, дауэкс-50 (Н+К амберлит IR-100 (Н+) или другие смолы подобного типа.

Соляная кислота (1 н.).

Водонасыщенный фенол: равные объемы дважды перегнанного жидкого фенола и воды наливают в плотно закрывающуюся бутыль, встряхивают и сливают слой фенола. Водонасыщенный фенол хранят в склянке нз темного стекла при 4°С. Для каждого опыта его готовят заново из дважды перегнанного фенола, хранящегося при —20 °С. (Предостережение! Фенол вызывает сильные ожоги. При работе с ним нужно надевать защитные перчатки, одежду и очки, а перегонку необходимо проводить в вытяжном шкафу.)

Смесь метанола и воды (10 : 9; по объему).

Этанол абсолютный (ч. д. a.; reagent grade).

Уксусная кислота ледяная (ч. д. a.; reagent grade).

Гексан, чистый для спектрофотометрии (Merk and Co., Inc., Rahway, N. Y.).

Пробирки на 15 мл со стеклянными пробками.

Хроматографическая бумага Whatman № 1; размер бумаги за/-висит от величины хроматографической камеры.

Камера для нисходящей бумажной хроматографии.

Ампулы для лиофилнзации на 10 мл.

Лиофилизатор или вакуумный испаритель.

Стандарты фосфолипидов: фосфатндилхолии (днстеароиловыйг эфир), фосфатидилсерии из бычьего мозга, фосфатидилэтаноламин из Е. coli, фосфатндил-К^-диметнлэтаноламин (дипальмитоиловый эфир), фосфатйдилглицерин (кардиолипин) из бычьего сердца.

Реактив Драгендорфа для опрыскивания: 1,7 г нитрата висмута растворяют в 100 мл 20%-ной уксусной кислоты. 10 г иодида калия растворяют в 25 мл воды. Непосредственно перед использованием смешивают 5 мл раствора иодида калия, 20 мл раствора нитрата висмута и 70 мл воды. Эту смесь применяют для опрыскивания.

Раствор нингндрнна: 0,25 г ниигидрина (ч. д. a.; reagent grade) растворяют в 100 мл смеси ацетона и лютидена (2,6-диметилпириди-на; 9:1, по объему). Используют свежеприготовленный реактив. (Осторожно! Нингидрин может вызывать аллергическую реакцию.)

Методика

Кислотный гидролиз фосфолипидов и

страница 56
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84

Скачать книгу "Методы общей бактериологии. Том 2" (4.15Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(21.07.2019)