Биологический каталог




Методы общей бактериологии. Том 2

Автор Ф.Герхардт

бавлении суспензии клеток водой или хлороформом образуется двухфазный слой. Липиды остаются в хлороформной фазе, а нелипидные вещества — в метанольно-водной. Отделив хлороформный слой, можно выделить и очистить липиды, как описано ниже. Выход суммарных неочищенных липидов после отделения от нелипидных примесей должен быть выше 95%.

Хара и Радин [25] описали другую методику, не требующую применения хлороформа. Ее преимущество заключается в том, что в отличие от метода Блая и Дайе-ра она позволяет заменить стадию фильтрования центрифугированием. Для экстракции липидов используется смесь гексана и изопропанола, а вещества нелипидной природы удаляются промыванием экстракта водным раствором сульфата натрия. Экстракт липидов можно фракционировать на колонках с силикагелем, используя гексан, изопропанол и водные смеси.

Реактивы и материалы

Абсолютный метанол и хлороформ, применяют чистые свежепе-регнанные реактивы (х. ч.; analytical grade). (Предостережение! Хлороформ оказывает вредное действие на печень и является анасте-зирующим средством. Во избежание контакта сг жидкостью или парами следует работать в вытяжном шкафу. Метанол очень легко* воспламеняется и ядовит при попадании через рот.)

Фильтровальная бумага Whatman № 1.

Фарфоровая воронка Бюхнера диаметром 43 мм.

Колба Бюхнера на 125 мл.

Методика

Густую пасту из 5 г влажных клеток или 1 г лио-филизованных клеток и 4 мл дистиллированной воды смешивают с 5 мл хлороформа и 10 мл метанола в пробирке со стеклянной пробкой. Смесь встряхивают в течение 5 мин и оставляют при комнатной температуре на 3—4 ч, периодически встряхивая. Добавляют еще 5 мл хлороформа и 5 мл дистиллированной воды и встряхивают смесь при комнатной температуре в течение 30 мин.

Экстракт быстро фильтруют через фильтровальную бумагу Whatman № 1 под слабым вакуумом. Фильтрат переносят в стеклянный мерный цилиндр для разделения слоев.

Метанольно-водный слой полностью удаляют отсасыванием. Остаток клеточного материала вновь экстрагируют 5 мл хлороформа, фильтруют через бумагу Whatman № 1 и промывают фильтр 12,5 мл хлороформа. •Фильтраты объединяют и добавляют к слою хлороформа, отделенного при первой экстракции.

Экстракты хлороформа помещают в доведенный до постоянного веса стеклянный или фарфоровый сосуд и выпаривают досуха под струей азота в водяной бане при 35—40 °С для получения сухого неочищенного суммарного препарата липидов. Все операции проводят в вытяжном шкафу.

Количество неочищенных суммарных липидов определяют с помощью аналитических весов.

17.3.2. Очищенные суммарные липиды [34]

Реактивы и материалы

Растворители: дважды перегнанный хлороформ (200 частей) и метанол (100 частей) смешивают с водой (75 частей). Энергично встряхивают в разделительной воронке и оставляют для разделения на верхнюю (растворитель I) и нижнюю (растворитель II) фазы. Каждую фазу сливают отдельно и хранят при комнатной температуре. (Предостережение! См. разд. 17.3.1.)

Сефадекс G-25 мелкогранулированный (Pharmacia Fine Chemi--cals, Inc., Piscataway, N. Y.).

Хроматографическая колонка размером 1X15 см с дном из пористого стекла и тефлоновым краном.

Методика

Принципы гель-фильтрации см. в разд. 16.3.7. 25 г сефадекса G-25 замачивают на ночь в 100 мл растворителя I. Растворитель над набухшими гранулами декантируют и промывают им же гранулы 4 раза.

Готовят густую суспензию из гранул в растворителе I (общий объем 50 мл) и дегазируют ее, поместив в сосуд под вакуумом на 10—15 мин. Суспензию изредка помешивают. Затем ее переливают в колонку, содержащую несколько миллилитров растворителя I. Продолжают добавлять суспензию до получения слоя сефадекса высотой 10 см. Создают давление 6,8-103—13,6*103 Па с помощью азота в баллоне для уплотнения слоя гранул сефадекса, на который затем помещают диск из стекловолокна. Колонку промывают 10 мл растворителя I и 10 мл растворителя II.

Растворяют 150—200 мг высушенной неочищенной фракции суммарных липидов в 2—5 мл растворителя П. Фильтруют полученный раствор через воронку с фильтром из пористого стекла прямо в колонку с сефадек-сом. Воронку промывают 2 мл растворителя II. Подают на колонку азот под давлением 13—20*103 Па, так чтобы скорость протекающего раствора была 0,5—1,0 мл/ /мин. Подключают к колонке растворитель II и собирают фракцию объемом 25 мл, прошедшую через колонку.

Элюат концентрируют при пониженном давлении и комнатной температуре до получения мутной водной эмульсии. Эмульсию лиофилизуют. Высушенные липиды растворяют в смеси хлороформа и метанола (2:1, по объему), переносят в сосуды с известным весом и выпаривают растворители в токе азота при 35—40 °С. Сушку завершают в вакуумном эксикаторе с парафиновой стружкой. После высушивания сосуд с сухим липидным экстрактом взвешивают.

Степень извлечения липидов на стадиях экстракции и очистки можно определить в контрольном эксперименте с использованием известных количеств очищенных суммарных липидов.

17.3.3. Классы липидов

Липиды могут связываться с твердым адсорбентом в хроматографической колонке. В качестве адсорбента чаще всего используют кремневую кислоту, окись алюминия и окись магния (разд. 16.3.2). Липиды связываются с помощью полярных, ионных и вандерваальсовых, сил. Разделение осуществляют с использованием растворителей увеличивающейся полярности, которые позволяют разделять липиды на классы, определяемые количеством и характером полярных групп в их молекулах [19, 20].

Описанный здесь метод основан на использовании обработанного кислотой флорисила. В качестве растворителей для элюирования адсорбированных липидов применяют хлороформ, смесь хлороформа и ацетона и метанол. Их выбор определяется простотой и воспроизводимостью методики, а также тем, что все фосфолипи-ды элюируются в одной фракции.

Реактивы и материалы

Флорисил, обработанный кислотой: смешивают 100 г флорисила {60—100 меш, Fisher Scientific Со.) с 350 мл концентрированной НО в колбе Эрленмейера объемом 1 л и нагревают в течение 3 ч на кипящей водяной бане под тягой. [Предостережение! Следует избегать вдыхания паров НС1. Работая с сильными кислотами, необходимо соблюдать^ все меры предосторожности и не допускать попадания жидкости нли паров на кожу или в глаза.) Надосадочную жидкость осторожно декантируют и промывают отстоявшийся сорбент 50 мл концентрированной НС1. Добавляют еще 350 мл концентрированной НС1 и нагревают суспензию в течение 12—16 ч (или в течение ночи) в кругло донной колбе с обратным холодильником при 100°С. Все операции выполняют очень осторожно в вытяжном шкафу, избегая вдыхания паров. НС1 сливают и выбрасывают, находящийся в осадке адсорбент трижды промывают дистиллированной водой путем декантации, а затем — в воронке Бюхнера до нейтрализации промывных вод. Остаток высушивают вначале отсасыванием на воронке, а затем нагреванием флорисила прн 120 °С в стеклянной чашке в течение ночи. Еще раз обрабатывают кислотой и промывают водой. Воду нз адсорбента удаляют, отсасывая на воронке. Последовательно добавляют 150 мл метанола, 150 мл смеси метанол—хлороформ (1 : 1, по объему), 150 мл хлороформа и 150 мл эфира. Адсорбент высушивают в течение ночи прн 120 °С в стеклянной чашке. (Предостережение! Эфир может взрываться при контакте с пламенем или раскаленными электрическими проводами. Его удаляют из адсорбента как можно полнее, и сушку проводят в вытяжном шкафу.)

Свежеперегнанный хлороформ. (Предостережение! См. разд. 17.3.1.)

Ацетон и метанол. (Предостережение! См. 17.3.1.)

Стеклянная хроматографическая колонка размером 1X30 см, снабженная емкостью для растворителя (делительной воронкой с тефлоновым краном), укрепляемой в верхней части колонки с помощью стеклянного шлифа 24/49, очищенного от смазки. В нижней части колонки должен находиться фильтр из пористого стекла или тампон из стекловаты, а также тефлоновый кран.

Методика

12 г обработанного кислотой флорисила суспендируют в дважды перегнанном хлороформе. Суспензию помещают в колбу или в эксикатор и дегазируют под вакуумом в течение 10 мин. Дегазированную суспензию переносят в хроматографическую колонку и дают возможность хлороформу вытекать из колонки до тех порг пока его уровень не будет приблизительно на 1 мм превышать уровень адсорбента.

150—200 мг очищенных суммарных липидов (см. предыдущую методику) растворяют в 3 мл хлороформа. Раствор наносят на колонку и дают ему впитаться такг чтобы сверху почти не было жидкости. Добавляют еще 5 мл хлороформа и ждут, пока он весь войдет в колонку. Осторожно с помощью делительной воронки наносят на колонку 50 мл хлороформа, не разрушая поверхностного слоя адсорбента. Дают растворителю пройти через колонку, собирая элюат в коллекторный сосуд со-скоростью, не превышающей 1 мл/мин. Когда хлороформ войдет в слой адсорбента, делительную воронку заполняют 60 мл смеси хлороформа и ацетона. Элюат собирают во второй коллекторный сосуд со скоростью,, не превышающей 1 мл/мин. Когда эта смесь растворителей войдет в слой адсорбента, в воронку вносят 60 мл ацетона и собирают элюат в тот же сосуд. Затем наливают в воронку 60 мл метанола и собирают элюат в третий сосуд.

В первом коллекторном сосуде содержатся нейтральные липиды (углеводороды, каротиноиды, хлорофилл, стериньг и эфиры стеринов, глицериды, воска, спирты с длинными цепями и альдегиды) и жирные кислоты; во втором — гликолипиды, сульфолипиды, а иногда и некоторые фосфатиды, в третьем — фосфолипиды. Последние можно обнаружить и количественно определить с помощью реакции на органический фосфат (разд. 17.3.5).

17.3.4. Фракционирование фосфолипидов

Фракционирование фосфолипидов проводят с помощью тонкослойной хроматографии, используя множество различных систем растворителей и камер [19г 20, 31].

Реактивы и материалы

Стеклянные пластинки размером 20X20 см, с толщиной слоя -силнкагеля 250 мкм. Можно приобрести готовые пластинки с сили-кагелем или приготовить самим, нанося снликагель на стеклянные пластннкн [20]. Пластинки ставят в камеру с дважды перегнанным ацетоном и пропускают последний до их верхнего края. Затем их высушивают на воздухе

страница 55
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84

Скачать книгу "Методы общей бактериологии. Том 2" (4.15Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(24.08.2019)