Биологический каталог




Методы общей бактериологии. Том 2

Автор Ф.Герхардт

стым стеклянным фильтром для удаления нерастворимых веществ. Отфильтрованный гидролизат помещают в колонку, изготовленную из пастеровской пипетки, заполненной 1 г ионообменной смолы дауэкс-50. Колонку промывают 15 мл воды, элюат выливают. Гексозамины элюируют 10 мл 2 н. НС1, элюат высушивают в вакуумном эксикаторе над гранулированным NaOH. Добавляют 2 мл воды и снова высушивают.

Во время сушки гидролизатов и элюирования из колонки под влиянием концентрированной НС1 разрушается значительное количество мурамовой кислоты. Потери этого соединения могут быть различными, и поэтому при определении суммарных гексозаминов описанная методика часто дает заниженные результаты.

Высушенную фракцию гексозамина растворяют в 0,1 мл воды и определяют количество гексозаминов, как описано выше (разд. 17.2.6). Проведение гидролиза делает необязательными обработку 3 н. НС1 и последующую нейтрализацию.

Применение методики

Очистка гексозаминов необходима при анализе сложных полимеров, отличных от пептидогликанов (например, липополисахаридов). Методику можно применять к целым бактериальным клеткам (помня о том, что выход мурамовой кислоты варьирует), а также для определения гексозаминов в культуральных средах.

17.2.8. Мурамовая кислота

Мурамовая кислота встречается только как компонент пептидогликанов клеточных стенок бактерий, в том числе цианобактерий. Она присутствует у всех прокариот, за исключением организмов, относящихся к архебак-териям [9, 11, 14]. Содержание мурамовой кислоты в клеточной суспензии является показателем присутствия и количества пептидогликанов. Количественный анализ этого соединения используется для определения количества бактериальной биомассы в почвах и воде >[10, 14].

Наиболее удобные и специфические способы определения мурамовой кислоты включают щелочную обработку кислотных гидролизатов клеточных стенок для удаления D-лактата из 3-го положения мурамовой кислоты. Затем проводят количественный анализ D-лактата ферментативным методом, описанным Типпером [17], согласно которому молочную кислоту определяют с помощью лактатдегидрогеназы, или же колориметрическим методом Хадзии [12].

Реактивы и оборудование

Раствор сульфата меди: 4 г CuS04 растворяют в 100 мл дистиллированной воды.

Л-Гидроксидифенильный реактив: 1,5 г л-гидроксидифенила растворяют в 95%-ном (объем/объем) этаноле.

Основной раствор мурамовой кислоты: мурамовую кислоту tSigma Chernical Co., St. Louis, Mo) растворяют в воде до концентрации 0,25 мг/мл. Мурамовая кислота содержит 30% по весу молочной кислоты, присоединенной эфирной связью.

20-мл пробирки, имеющие завинчивающиеся крышки с тефлоно-выми прокладками.

Спектрофотометр или колориметр и стеклянные кюветы или пробирки для колориметра.

Вся стеклянная посуда должна быть тщательно вымыта и ополоснута серной кислотой. После мытья нельзя допускать попадания На нее пыли и оставлять на ней отпечатки пальцев.

Методика

Пробы гидролизованного пептидогликана, содержащие от 5 до 50 мкг мурамовой кислоты, вносят в пробирки, имеющие завинчивающиеся крышки с тефлоно-выми прокладками, и нейтрализуют равным объемом 4 н. NaOH. Готовят стандартные растворы, содержащие 1—10 мкг молочной кислоты в составе мурамовой кислоты, а также контрольную пробу с реактивом. Объем всех проб доводят до 1 мл дистиллированной водой. Добавляют еще 0,5 мл 1н. NaOH и инкубируют при 37 °С в течение 30 мин. Добавляют 10 мл серной кислоты, пробирки закрывают и нагревают 10 мин в кипящей воде. После охлаждения добавляют 0,1 мл сульфата меди и 0,2 мл /г-гидроксифенильного реактива и быстро перемешивают с помощью встряхивателя Vortex. Пробирки инкубируют в водяной бане при 30 °С в течение 30 мин, после чего измеряют оптическую плотность при 560 нм. Концентрацию мурамовой кислоты определяют по стандартной калибровочной кривой, отражающей зависимость между оптической плотностью в стандартных пробах и концентрацией в них мурамовой кислоты.

Применение методики

Мы привели описание простого, быстрого, не требующего дорогих реактивов и приборов способа определения мурамовой кислоты в отсутствие молочной кислоты, образуемой бактериями в процессе метаболизма. Определению не мешают ни другие компоненты пептидогликана, ни уроновые кислоты и нейтральные сахара при их содержании в пробе до 250 мкг.

17.2.9. 2-Кето-З-дезоксиоктановая кислота

2-Кето-З-дезоксиоктановую кислоту (КДО) в липо-полисахаридах определяют по методу Вейсбаха и Хур-витца [18], модифицированному Осборном [13]. При окислении периодатом КДО дает формилпировиноград-ную кислоту, которая, реагируя с тиобарбитуровой кислотой, образует хромофор с максимумом оптической-плотности при 550 нм. Дезоксисахара, кроме 2-кето-З-дезоксисахарных кислот, образуют различные окрашенные продукты, имеющие максимум оптической плотности при длинах волн, которые находятся вне диапазона 545—550 нм.

Реактивы

Периодатиый реактив: НЮ4 растворяют в 0,125 и. H2S04 до концентрации 0,025 н.

Разбавленная серная кислота: 0,02 и. H2SO4. (Предостережем ние! См. разд. 17.2.2.)

Раствор арсенита натрия: 0,2 н. арсеннт натрия растворяют в 0,5 н. НС1. (Предостережение! Арсенит натрия ядовит. Следует избегать вдыхания порошка. После работы с реактивом необходимо хорошо вымыть руки. Нельзя насасывать раствор в пипетку ртом.)

Тиобарбитуровая кислота: готовят 0,3%-ный раствор в дистиллированной воде, рН 2.

Методика

Лиофилизованный полисахарид, содержащий от 0,01 до 0,25 мкмолей КДО, растворяют в 0,1 мл 0,02 н. H2SO4 и инкубируют при 100 °С в течение 20 мин для выделения КДО из полимера.

Образцы гидролизата разбавляют 0,2 н. H2SO4 до С,2 мл. Добавляют 0,25 мл периодатного реактива, перемешивают и оставляют на 20 мин при комнатной температуре. Добавляют 0,5 мл 0,2 н. раствора арсенита натрия. Инкубируют 2 мин при комнатной температуре и добавляют 2 мл 0,3%-ной тиобарбитуровой кислоты, рН 2. Перемешивают и инкубируют при 100 °С в течение 20 мин. Охлаждают и определяют оптическую плотность при 548 нм.

Величина оптической плотности 1 мкмоля КДО, намеренная в 1-см кювете, равна 19,0.

Применение методики

Описанная выше процедура применима для определения КДО в очищенных липополисахаридах или препаратах клеточной стенки.

17.2.10. Гептозы

Продукт, выделяющийся при нагревании гептозы с серной кислотой, реагирует с цистеингидрохлоридом, образуя вещество с интенсивной оранжевой окраской. Это вещество превращается в соединение розового цвета имеющее максимум оптической плотности при 505 нм [13].

Реактивы

Раствор серной кислоты: 6 частей концентрированной H2SO4 добавляют к 1 части воды. (Предостережение! См. разд. 17.2 2.)

Раствор цистеингидрохлорида: 0,3 г цистеингидрохлорида растворяют в 10 мл дистиллированной воды.

Методика

Пробы объемом 0,5 мл помещают в ледяную баню. Добавляют по 2,25 мл раствора серной кислоты. Пробирки с пробами встряхивают 3 мин в ледяной бане. Переносят в водяную баню с температурой 20 °С на 3 мин, а затем нагревают в кипящей воде в течение 10 мин. Охлаждают, добавляют по 0,05 мл раствора цистеингидрохлорида и хорошо перемешивают. Через 2 ч после добавления цистеингидрохлорида определяют оптическую плотность при 505 и 545 нм. Для настройки прибора на нуль при каждой длине волны используют контрольную пробу, содержащую все указанные реактивы, кроме цистеингидрохлорида.

Результат определяют по разности величин оптической плотности при 545 и 505 нм. 1 мкмоль Ь-глицеро-D-манногептозы в 1 мл при ширине кюветы 1 см имеет оптическую плотность 1,07.

Применение методики

Для обнаружения дезоксигексоз и дезоксипентоз можно применять методику, описанную Дише [7]. Приведенная здесь модифицированная методика Осборна [13] представляет собой довольно специфический способ определения гептоз в очищенных препаратах гликопро-теинов и липополисахаридов.

17.3. ЛИПИДЫ

Липиды — это химически разнообразная группа биологических веществ, нерастворимых в воде, но растворяющихся в органических растворителях и содержащих обычно длинные углеводородные цепи. Это определение относится к углеводородам с длинными цепями, спиртам, альдегидам, жирным кислотам и их производным, включая глицериды, фосфолипиды, гликолипиды и сульфоли-пиды.

К липидам часто относят стерины, жирнокислот-ные эфиры стеринов, витамины A, D, Е и К, каротинои-ды и другие полиизопреноиды, поскольку они связаны с мембранами и могут экстрагироваться теми же растворителями, что и другие липиды. Обзор типов и строения липидов бактериальной клетки сделал О'Лири [21].

Липиды содержатся в плазматических мембранах всех живых клеток. Бактериальные мембраны устроены гораздо проще, чем мембраны эукариотических клеток. Однако известно, что бактерии содержат, кроме фосфо-липидов, очень много разнообразных липидов. К ним относятся сфинголипиды, нейтральные липиды, гликолипиды и множество необычных липидов, присутствующих, например, у бактерий таких родов, как Corynebactenum> Nocardia и Mycobacterium {21]. Считалось, что прокариоты не содержат стеринов. Однако недавно было показано, что в бактериях присутствует сквален и множество различных стеринов [22, 28]. Грамотрицательные бактерии содержат в наружной мембране уникальные липиды в липополисахаридных комплексах [21]. В цитоплазме некоторых бактерий накапливается в больших количествах поли-р-гидроксимасляная кислота, служащая источником углерода и энергии.

Ввиду сложности состава бактериальных липидов описание способов суммарного анализа каждого их класса здесь невозможно. Варианты приведенных ниже методик, а также сложные способы более полного анализа бактериальных липидов можно найти в специальных статьях на эту тему [19, 20].

17.3.1. Неочищенные суммарные липиды

По сравнению с другими методиками способ экстракции суммарных неочищенных липидов, описанный Блаем и Дайером [23], занимает меньше времени и требует меньшего числа процедур. Эта методика широко используется в работе с бактериями. Клетки смешивают с хлороформом и метанолом, взятыми в количествах, при которых образуется монофазный раствор после смешивания с внутриклеточной водой [24]. При раз

страница 54
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84

Скачать книгу "Методы общей бактериологии. Том 2" (4.15Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(11.12.2019)